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CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在各种生物中实现基因组编辑。英茂盛业采用新研发的大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒(CR3010),实现了敲除BL21菌种中的lacZ(β-半乳糖苷酶)基因,敲除效率高达90%。
实验原理
β-半乳糖苷酶基因是大肠杆菌乳糖代谢途径中的一个酶。β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。这个反应被广泛用于基因工程中蓝白斑筛选鉴定重组质粒。通过CRISPR/Cas9编辑β-半乳糖苷酶基因,造成β-半乳糖苷酶基因功能缺失,编辑后的BL21菌种将不能代谢X-gal产生蓝斑。
实验材料
Clone Direct PCR Mix(英茂盛业,P3001)
靶点和实验方案设计
根据BL21中β-半乳糖苷酶基因序列,设计基因敲除靶点和重组修复模板。
设计方案:
基因编辑后序列:
设计的引物列表:
引物名称 |
序列5’-3’ |
用途 |
LacZ-target |
TCCTAGGTATAATACTAGTcgttttacaacgtcgtgactGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
合成sgRNA表达框。 |
lacZ-JD-F |
TTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT |
PCR鉴定基因编辑克隆,阴性145bp,阳性119bp。 |
lacZ-JD-F |
AGGGGGATGTGCTGCAAGGCGA |
|
LacZ-HR-F |
TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCAAAACC |
合成重组模板 |
LacZ-HR-R |
GGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTGCCAGTGAATCCG |
实验步骤
一、制备表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞
1、pFN-Cas9载体转化BL21菌种。
制备BL21化学感受态细胞,用pFN-Cas9载体进行转化。用含amp抗性的LB平板筛选出阳性克隆。
2、按照说明书将含pFN-Cas9质粒的BL21菌种制备为电转化感受态细胞。
二、构建pFG-sgRNA载体。
1、插入片段PCR扩增:
扩增体系:
sgRNA-F1 primer |
1μl |
sgRNA-R2 primer |
1μl |
LacZ-target |
0.5μl |
PCR template |
0.5μl |
Clone Direct PCR Mix |
25μl |
H2O |
22μl |
Total |
50μl |
反应程序:
95℃ 2min
95℃ 10sec
60℃ 15sec 10 cycles
72℃ 30sec
95℃ 10sec
58℃ 15sec 15 cycles
72℃ 30sec
琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物备用。
2、pFG-sgRNA载体连接:
配制连接体系:
胶回收的PCR产物 |
0.5μl |
pFG-sgRNA载体 |
2μl |
Loop Ligation Enzyme Mix |
0.5μl |
Loop Ligation Buffer |
1μl |
H2O |
6μl |
Total |
10μl |
连接反应:
37℃ 5min
16℃ 10min
10 cycles
3、连接产物转化dH5a感受态,挑取克隆测序。正确的质粒命名为pFG-sgRNA-lac。
三、合成同源重组模板。
1、PCR扩增同源重组模板:
扩增体系:
LacZ-HR-F |
2μl |
LacZ-HR-R |
2μl |
Clone Direct PCR Mix |
25μl |
H2O |
21μl |
Total |
50μl |
扩增条件:
95℃ 2min
95℃ 10sec
58℃ 15sec 25 cycles
72℃ 30sec
乙醇沉淀回收PCR产物,定量。
四、pSG-sgRNA载体、重组模板转化表达Cas9蛋白的BL21感受态。
1、按照下表配制转化Mix,分别电转化表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞。
组1 |
组2 |
pSG-sgRNA-lac 50ng |
pSG-sgRNA 50ng |
重组模板 400ng |
重组模板 400ng |
实验结果
1、PCR克隆鉴定实验结果:
2、Xgal平板显色检测结果
用到的产品: