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CRISPRCas9基因敲除大肠杆菌BL21菌种中的lacZ基因

    CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在各种生物中实现基因组编辑。英茂盛业采用新研发的大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒(CR3010),实现了敲除BL21菌种中的lacZ(β-半乳糖苷酶)基因,敲除效率高达90%。

    实验原理

    β-半乳糖苷酶基因是大肠杆菌乳糖代谢途径中的一个酶。β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。这个反应被广泛用于基因工程中蓝白斑筛选鉴定重组质粒。通过CRISPR/Cas9编辑β-半乳糖苷酶基因,造成β-半乳糖苷酶基因功能缺失,编辑后的BL21菌种将不能代谢X-gal产生蓝斑。

     

    实验材料

    大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒(英茂盛业,CR3010)

    Clone Direct PCR Mix(英茂盛业,P3001)

     

    靶点和实验方案设计

    根据BL21中β-半乳糖苷酶基因序列,设计基因敲除靶点和重组修复模板。

    设计方案:

    基因编辑后序列:

    设计的引物列表:


    引物名称

    序列5’-3’

    用途

    LacZ-target

    TCCTAGGTATAATACTAGTcgttttacaacgtcgtgactGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

    合成sgRNA表达框。

    lacZ-JD-F

    TTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT

    PCR鉴定基因编辑克隆,阴性145bp,阳性119bp。

    lacZ-JD-F

    AGGGGGATGTGCTGCAAGGCGA

    LacZ-HR-F

    TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCAAAACC

    合成重组模板

    LacZ-HR-R

    GGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTGCCAGTGAATCCG

     

    实验步骤

    一、制备表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞

    1、pFN-Cas9载体转化BL21菌种。

    制备BL21化学感受态细胞,用pFN-Cas9载体进行转化。用含amp抗性的LB平板筛选出阳性克隆。

    2、按照说明书将含pFN-Cas9质粒的BL21菌种制备为电转化感受态细胞。

    二、构建pFG-sgRNA载体。

    1、插入片段PCR扩增:

    扩增体系:


    sgRNA-F1 primer

    1μl

    sgRNA-R2 primer

    1μl

    LacZ-target

    0.5μl

    PCR template

    0.5μl

    Clone Direct PCR Mix

    25μl

    H2O

    22μl

    Total

    50μl

    反应程序:
    95℃      2min

    95℃     10sec
    60℃     15sec    10 cycles
    72℃     30sec

    95℃     10sec
    58℃     15sec    15 cycles
    72℃     30sec
    琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物备用。

    2、pFG-sgRNA载体连接:

    配制连接体系:


    胶回收的PCR产物

    0.5μl

    pFG-sgRNA载体

    2μl

    Loop Ligation Enzyme Mix

    0.5μl

    Loop Ligation Buffer

    1μl

    H2O

    6μl

    Total

    10μl

    连接反应:

    37℃      5min
    16℃     10min

    10 cycles

    3、连接产物转化dH5a感受态,挑取克隆测序。正确的质粒命名为pFG-sgRNA-lac。

    三、合成同源重组模板。

    1、PCR扩增同源重组模板:

    扩增体系:

    LacZ-HR-F

    2μl

    LacZ-HR-R

    2μl

    Clone Direct PCR Mix

    25μl

    H2O

    21μl

    Total

    50μl


    扩增条件:
    95℃      2min
    95℃     10sec
    58℃     15sec    25 cycles
    72℃     30sec
    乙醇沉淀回收PCR产物,定量。

    四、pSG-sgRNA载体、重组模板转化表达Cas9蛋白的BL21感受态。

    1、按照下表配制转化Mix,分别电转化表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞。

    组1

    组2

    pSG-sgRNA-lac 50ng

    pSG-sgRNA 50ng

    重组模板 400ng

    重组模板 400ng

    转化产物涂含Xgal/amp/Str平板,30℃培养过夜。挑取克隆用lacZ-JD-F/R进行鉴定。

    实验结果

    1、PCR克隆鉴定实验结果:

    lacresult-1.jpg

    2、Xgal平板显色检测结果

    用到的产品:

    大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒(英茂盛业,CR3010)

     


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