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spCas9体外酶切试剂盒 (PC1400)
货号:PC1400
本产品主要用于CRISPR/spCas9系统体外酶切实验、CRISPR靶点筛选等实验。可以在体外切割PCR产物、质粒等双链DNA。
试剂盒中提供了spCas9体外酶切所需试剂,包括spCas9蛋白,反应缓冲液,以及对照sgRNA和底物DNA。使用该试剂盒可以快速开展spCas9体外酶切实验。
产品特点:
产品规格:
货号 |
PC1400-S0 (5次) |
PC1400-S1 (5次) |
PC1400-0 (20次) |
PC1400-1 (20次) |
PC1400-5 (100次) |
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spCas9蛋白 |
25U |
25U |
100U |
100U |
500U |
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10×spCas9 Buffer |
35μl |
35 μl |
150μl |
150 μl |
600 μl |
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阳性对照sgRNA |
- |
10 μl |
- |
25 μl |
125 μl |
|
阳性对照DNA |
- |
20 μl |
- |
50 μl |
250 μl |
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Cleaner试剂 |
25 μl |
25 μl |
100 μl |
100 μl |
500 μl |
|
3M NaAc pH5.2 |
- |
50 μl |
- |
150 μl |
600 μl |
活性定义:37℃,30分钟切割1μg 1kB DNA双链定义为1个活性单位。
储存条件:-20℃冻存
实验步骤:
1、spCas9切割反应:
1.1 需准备:底物DNA,浓度大于100ng/ul;sgRNA,浓度大于200ng/ul。
!务必采用无RNA酶的耗材进行实验,注意防止RNA酶污染。
按照下表配制spCas9体外切割反应缓冲液,请按表中顺序加入:
spCas9蛋白 |
5 μl |
sgRNA |
1 μg(a μl) |
底物DNA |
1~2 μg(b μl) |
10×spCas9 Buffer |
X μl* |
*X=0.1×(5+a+b) |
|
阳性对照反应:
spCas9蛋白 |
5 μl |
阳性对照sgRNA |
5 μl |
阳性对照DNA |
10 μl |
10×spCas9 Buffer |
2 μl |
1.2吹吸混合均匀。
反应程序:
37℃ 30min
85℃ 10min
2、产物检测:
快速检测:
1)在反应体系中加入5μl Cleaner,混匀。55℃孵育5min。(本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作)
2)取5μl进行凝胶电泳检测(不必加入DNA Loading Buffer) 。
乙醇沉淀法检测:
本方案耗时约30min,电泳条带更清晰。
本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作。
1)加水将反应产物补足50μl。
2)加入50μl酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。
3)室温12000rpm离心5min。
4)取上清至新的1.5ml离心管,加入5 μl 3M NaAc pH5.2,混匀。
5)加入110μl无水乙醇,混匀。
6)4℃ 12000rpm离心10min。
7)去除上清,加入500μl 70%乙醇,震荡混匀。
8)4℃ 12000rpm离心5min。
9)去除上清,空离心2min,12000rpm,用移液器尽量吸去残留液体,开口室温放置2-5min。
10)加入10-15μl蒸馏水,震荡溶解沉淀。取3-5μl进行凝胶电泳检测。
阳性对照电泳图
阳性对照DNA为760bp 双链DNA。含有单一靶点。切割产物310bp、450bp。
M:DL2000 DNA marker
4:spCas9蛋白加gRNA切割0min
3:spCas9蛋白加gRNA切割10min
2:spCas9蛋白加gRNA切割30min
1:spCas9蛋白不加gRNA切割30min
产品保存和使用注意事项:
1.spCas9蛋白使用过程中尽量保持低温。
2.阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用,以免RNase污染导致降解。
3.若切割效果不理想,可提高sgRNA的含量。
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