微信扫一扫
下载说明书
微信扫一扫
下载说明书
优惠信息
CRISPR/Cas9
细胞系服务
细胞株现货产品
慢病毒载体
服务
订购指南
关于我们
spCas9体外酶切试剂盒 (PC1400)
货号：PC1400
本产品主要用于CRISPR/spCas9系统体外酶切实验、CRISPR靶点筛选等实验。可以在体外切割PCR产物、质粒等双链DNA。
试剂盒中提供了spCas9体外酶切所需试剂，包括spCas9蛋白，反应缓冲液，以及对照sgRNA和底物DNA。使用该试剂盒可以快速开展spCas9体外酶切实验。
产品特点：
产品规格：
| 货号 |
PC1400-S0 (5次） |
PC1400-S1 （5次） |
PC1400-0 （20次） |
PC1400-1 （20次） |
PC1400-5 （100次） |
|
|
|
spCas9蛋白 |
25U |
25U |
100U |
100U |
500U |
|
|
10×spCas9 Buffer |
35μl |
35 μl |
150μl |
150 μl |
600 μl |
|
|
阳性对照sgRNA |
- |
10 μl |
- |
25 μl |
125 μl |
|
|
阳性对照DNA |
- |
20 μl |
- |
50 μl |
250 μl |
|
|
Cleaner试剂 |
25 μl |
25 μl |
100 μl |
100 μl |
500 μl |
|
|
3M NaAc pH5.2 |
- |
50 μl |
- |
150 μl |
600 μl |
活性定义：37℃，30分钟切割1μg 1kB DNA双链定义为1个活性单位。
储存条件：-20℃冻存
实验步骤：
1、spCas9切割反应：
1.1 需准备：底物DNA，浓度大于100ng/ul；sgRNA，浓度大于200ng/ul。
！务必采用无RNA酶的耗材进行实验，注意防止RNA酶污染。
按照下表配制spCas9体外切割反应缓冲液，请按表中顺序加入：
|
spCas9蛋白 |
5 μl |
|
sgRNA |
1 μg（a μl） |
|
底物DNA |
1~2 μg（b μl） |
|
10×spCas9 Buffer |
X μl* |
|
*X=0.1×(5+a+b) |
|
阳性对照反应：
| spCas9蛋白 |
5 μl |
|
阳性对照sgRNA |
5 μl |
|
阳性对照DNA |
10 μl |
|
10×spCas9 Buffer |
2 μl |
1.2吹吸混合均匀。
反应程序：
37℃ 30min
85℃ 10min
2、产物检测：
快速检测：
1）在反应体系中加入5μl Cleaner，混匀。55℃孵育5min。（本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作）
2）取5μl进行凝胶电泳检测（不必加入DNA Loading Buffer） 。
乙醇沉淀法检测：
本方案耗时约30min，电泳条带更清晰。
本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作。
1）加水将反应产物补足50μl。
2）加入50μl酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。
3）室温12000rpm离心5min。
4）取上清至新的1.5ml离心管，加入5 μl 3M NaAc pH5.2，混匀。
5）加入110μl无水乙醇，混匀。
6）4℃ 12000rpm离心10min。
7）去除上清，加入500μl 70%乙醇，震荡混匀。
8）4℃ 12000rpm离心5min。
9）去除上清，空离心2min，12000rpm，用移液器尽量吸去残留液体，开口室温放置2-5min。
10）加入10-15μl蒸馏水，震荡溶解沉淀。取3-5μl进行凝胶电泳检测。
阳性对照电泳图
阳性对照DNA为760bp 双链DNA。含有单一靶点。切割产物310bp、450bp。
M：DL2000 DNA marker
4：spCas9蛋白加gRNA切割0min
3：spCas9蛋白加gRNA切割10min
2：spCas9蛋白加gRNA切割30min
1：spCas9蛋白不加gRNA切割30min
产品保存和使用注意事项：
1.spCas9蛋白使用过程中尽量保持低温。
2.阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用，以免RNase污染导致降解。
3.若切割效果不理想，可提高sgRNA的含量。
相关产品：
| sgRNA体外转录试剂盒 | |
