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Cas9蛋白体外酶切实验

Cas9蛋白体外酶切实验

 实验背景:
CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可特异剪切外源的病毒及DNA以对抗入侵。

Cas9 /gRNA系统通过sgRNA（short guide RNA）引导Cas9蛋白识别并剪切带有sgRNA靶点的双链DNA，用于基因敲除和精确编辑DNA等操作。
利用人工表达的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA，可以体外切割质粒、PCR产物等双链DNA。可用于快速检测CRISPR靶点。

实验材料及仪器:
Cas9体外酶切试剂盒 （重庆英茂盛业，PC1400）
sgRNA体外转录试剂盒（重庆英茂盛业，PC1380）
DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京康为世纪，CW2302S）
DM2000 DNA marker（北京康为世纪，CW0632M）
仪器：37℃恒温箱；台式冷冻离心机；水平电泳槽等。

PCR扩增切割底物:   
PCR扩增β-半乳糖苷酶基因中1164bp片段，命名为lac。
PCR扩增pUC57质粒中760bp片段，命名为57。
琼脂糖凝胶回收PCR产物，定量后稀释为0.2ug/ul。 

sgRNA靶点设计:

sgRNA体外转录模板扩增:
按照sgRNA体外转录试剂盒说明，根据靶点序列设计引物，合成体外转录模板。
反应体系:

sgRNA体外转录模板扩增:
反应条件：
95℃  5min预热，                  
95℃  30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环

    
 
扩增200ul，琼脂糖凝胶回收PCR产物并定量。

sgRNA体外转录:
按照sgRNA体外转录试剂盒配制转录体系

反应条件：37℃ 孵育4h

Cas9 /gRNA切割底物:
按照Cas9体外酶切试剂盒说明配制反应体系:

反应条件： 37℃反应15分钟。

Cas9 蛋白切割产物电泳图1:
               片段57切割结果   

Cas9 蛋白切割产物电泳图2:
Lac片段切割结果:
   

结论
第一：CRISPR/Cas9系统不同的sgRNA的切割效率有比较明显的差异。

第二：Cas9体外切割实验的全部实验内容，包括sgRNA合成和切割底物扩增等，可在2天内完成。Cas9蛋白对底物的切割仅需15min。

第三：在进行耗时费力的基因敲除细胞构建或者基因敲除动物等工作之前，用简便的Cas9体外切割实验对CRISPR靶点进行验证，不失为一种稳妥的方案。