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Cas9蛋白体外酶切实验

Cas9蛋白体外酶切实验

 实验背景:
CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可特异剪切外源的病毒及DNA以对抗入侵。
Cas9 /gRNA系统通过sgRNA(short guide RNA)引导Cas9蛋白识别并剪切带有sgRNA靶点的双链DNA,用于基因敲除和精确编辑DNA等操作。
利用人工表达的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA,可以体外切割质粒、PCR产物等双链DNA。可用于快速检测CRISPR靶点。

 

实验材料及仪器:
Cas9体外酶切试剂盒 (北京英茂盛业,PC1400)
sgRNA体外转录试剂盒(北京英茂盛业,PC1380)
DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京康为世纪,CW2302S)
DM2000 DNA marker(北京康为世纪,CW0632M)
仪器:37℃恒温箱;台式冷冻离心机;水平电泳槽等。

 

PCR扩增切割底物:   
PCR扩增β-半乳糖苷酶基因中1164bp片段,命名为lac。
PCR扩增pUC57质粒中760bp片段,命名为57。
琼脂糖凝胶回收PCR产物,定量后稀释为0.2μg/μl。 
/uploads/图片1.png.
 

sgRNA靶点设计:

图片2.png

sgRNA体外转录模板扩增:
按照sgRNA体外转录试剂盒说明,根据靶点序列设计引物,合成体外转录模板。
反应体系:

带靶点引物(10μM)              

1μl

SG-R引物(10μM)

1μl

2×PCR Mix

25μl

PCR template DNA

0.5μl

H2O

to  50μl

sgRNA体外转录模板扩增:
反应条件:
95℃ 5min预热,                  
95℃ 30sec,56℃ 30sec,72℃ 30sec,35个循环

 

    
图片3.png  
扩增200μl,琼脂糖凝胶回收PCR产物并定量。
sgRNA体外转录:
按照sgRNA体外转录试剂盒配制转录体系

转录模板DNA

2μg

5×Transcription Buffer

4μl

NTP Mix

8μl

T7 Transcription Enzyme Mix

2μl

RNase Free H2O

to  20μl

反应条件:37℃ 孵育4h
图片0.png
 

Cas9 /gRNA切割底物:
按照Cas9体外酶切试剂盒说明配制反应体系:

Cas9蛋白

5ul

sgRNA

0.5ug

10×Cas9 Buffer

5μl

底物DNA

1ug

RNase Free H2O

to  50μl


反应条件: 37℃反应15分钟。


Cas9 蛋白切割产物电泳图1:
               片段57切割结果   
图片5.png
 

Cas9 蛋白切割产物电泳图2:
Lac片段切割结果:
   
图片6.png

结论
第一:CRISPR/Cas9系统不同的sgRNA的切割效率有比较明显的差异。

第二:Cas9体外切割实验的全部实验内容,包括sgRNA合成和切割底物扩增等,可在2天内完成。Cas9蛋白对底物的切割仅需15min。

第三:在进行耗时费力的基因敲除细胞构建或者基因敲除动物等工作之前,用简便的Cas9体外切割实验对CRISPR靶点进行验证,不失为一种稳妥的方案。


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