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筛选A459 circRNA稳定过表达细胞株

    近年来，随着对circRNA研究的深入，circRNA的重要性逐渐得到认识。circRNA在各种组织和细胞均有广泛分布，并且体现出组织差异性。研究表明，circRNA具有miRNA海绵、调节miRNA表达、部分circRNA具有蛋白翻译功能等多种功能。

   最新的研究表明，circRNA的产生是一个缓慢的过程。由于环状RNA比较稳定，在一个相对长的时间内慢慢累积，从而达到较高丰度(Zhang Y，et al.Cell Rep. 2016)。因此，慢病毒系统构建稳转细胞株特别适合环状RNA表达研究。在细胞中稳定转入circRNA表达结构，长期稳定表达circRNA，才能较好的模拟环状RNA的体内表达状态和功能。

   英茂盛业的慢病毒circRNA表达载体，可以大幅稳定提高circRNA表达量，精确表达指定circRNA。环化效率极高。特别适合circRNA的功能研究。

实验方案：将目的circRNA编码DNA构建到慢病毒circRNA表达载体。包装为慢病毒后转染A549细胞，筛选出稳定过表达目标circRNA的A549细胞株。

pLV-circ-Luci(2A)puro载体图谱：

图1、载体图谱

图2、circRNA表达框

实验步骤：

1. 将目标circRNA编码序列及其两端部分内含子序列通过酶切连接插入到慢病毒circRNA表达载体pLV-circ-Luci(2A)puro。

2. 将空载体pLV-circ-Luci(2A)puro及circRNA表达载体pLV-circRNA分别包装为病毒。

3. 转染A549细胞。用puromycin筛选出稳定细胞株。

4. 通过qPCR检测circRNA表达。

检测结果：
1、设计引物分别检测目标环状RNA及总RNA（环状RNA+线性RNA）。

图3、qPCR引物位置示意图

图4、qPCR检测circRNA过表达A549细胞及其对照细胞中目标环状RNA及总目标RNA表达。结果显示与对照组相比，目标环状RNA表达量显著增高。

2、circRNA qPCR产物测序结果

图5、circRNA qPCR产物测序结果显示环化部分剪切正确，序列与预期一致。

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