微信扫一扫

下载说明书

优惠信息
细胞系服务
细胞株现货产品
慢病毒载体
服务
订购指南
关于我们

在线询价


*电子邮件:

*电话:

*单位:

*感兴趣的服务或产品:

详细说明:

看不清?点击更换看不清?

当前位置:主页 > 技术中心 >

实时定量PCR中的常见问题及解决办法

     

    1、反应后无扩增曲线出现

1)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

2)扩增效率问题:电泳检测realtimePCR反应产物,观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有,则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。

3)循环数不够:一般可设置循环数为40。

 

2、Ct值出现太晚

1)模板浓度过低或模板降解:重新制备模板再进行实验。

2)扩增效率低:优化反应条件,或者重新设计PCR引物。

3)PCR产物过长:一般设计为100-200bp即可。

4)反应体系中含有抑制剂:常在模板质量不高时出现,重新制备模板或将模板稀释后使用。

 

3、扩增曲线形状异常

1)扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

2)扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4),重新分析数据。

3)个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

 

4、阴性对照出现扩增曲线

1)阴性对照在35个循环以后出现扩增曲线很有可能是因为出现引物二聚体,属于正常现象。可通过融解曲线分析进行判断。

2)反应体系被模板污染:更换水、反应试剂、引物。

 

5、标准曲线线性关系不佳

1)加样误差:将模板稀释,扩大体积是一个有效的解决办法。

2)标准品降解:重新制备标准品。

3)模板浓度过高:稀释模板重新实验。

 

6、实验重复性差

1)加样误差:将模板稀释,扩大体积是一个有效的解决办法。

2)模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差。适当增加模板量。

3)仪器误差:不同的孔温度控制不一致也会导致重复性差的问题。请专业人员对仪器进行校准。

 

7、融解曲线出现多峰

1)引物非特异扩增:重新设计引物,优化扩增条件。

2)引物浓度太高:引物浓度过高容易引起扩增条带弥散。适当降低引物浓度。

3)cDNA模板基因组DNA污染:重新制备cDNA。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理。

 

相关产品和服务

RealtimePCR试剂 RealtimePCR服务


  • 上一篇: TALEN敲除小鼠P53基因及talen质粒活性验证
  • 下一篇:CRISPR/Cas9基因脱靶作用

  • 版权所有 北京英茂盛业生物科技有限公司 网站备案:京ICP备1100746
    地址:北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B-916 电话:010-62495135 传真:010-62454561
    产品订购:order@inovogen.com 产品咨询:market@inovogen.com

    Cas9/基因敲除稳定细胞系构建/稳转细胞株稳转细胞系现货产品