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siRNA的合成方法

标签： 发布时间：2013-07-09

siRNA合成的方法主要包括：

1、化学合成

2、体外转录

3、长片断dsRNA经RNaseIII类降解（如Dicer、E.coli、RNaseIII）

4、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs

5、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达

前三种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。后两种方法的优点在于不需要直接操作RNA，依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有有缺点，具体那种方法最好取决于试验目的。

一、化学合成siRNA分子：

尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的。研究人员几乎不需要做什么工作。生物公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格相对来说比其他方法高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究

不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

二、体外转录合成siRNA分子：

通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。

优点：体外转录得到的siRNA毒性小，稳定性好，效率高。达到同样的转染效率只需要化学合成量的1/10。

最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA，长期研究。

三、用RNase III 消化长片断dsRNA制备siRNA：

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

优点：①有很高的有效性。②可跳过检测和筛选有效siRNA序列步骤，节省时间和金钱。

缺点：可引发非特异的基因沉默，特别是同源或密切相关的基因。

最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗

四、siRNA表达载体：

多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。如果您选择shRNA，有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的。此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板, 正义与反义序列之间由一段环(loop) 序列隔开, 插入载体Pol Ⅲ启动子下游, 然后转入细胞,环序列可使转录出的RNA 链折叠成具发夹结构的小RNA 分子, 这些小RNA 可被细胞内的Dicer 切割为长21bp 的siRNA 有19 对互补碱基, 3'端各有2 个U 突出, 可引起特定基因沉默。与化学合成及体外酶法合成相比, 表达载体是在细胞内通过转录持续产生siRNA , 所以可延长siRNA 作用时间, 目前此法已被广泛应用。

优点：可进行较长期研究，带有抗生素标记的载体可在细胞中持续抑制靶基因的表达。

最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。

不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）

五、siRNA表达框架：

siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。

优点：无需载体克隆测序，是最有效的筛选siRNA工具，甚至可用以筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA最适搭配。

缺点：PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想

缺点：①PCR产物很难转染到细胞中，②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想。

最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。

不适用于：长期抑制研究。