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RNAi表达载体构建

   近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示 了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等.

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：

◆化学合成

◆体外转录

◆长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)

◆siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs

◆PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达

获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的效率则是非常关键的因素.

一、基本概念

RNAi：（RNA interference）RNA干扰

   内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异基因表达沉默或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制.

siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA

由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA, RNAi的关键效应分子.

shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA

是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用.

Dicer：属于RNaseⅢ 家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶

RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA诱导的沉默复合体,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性

二、机制

   目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制,都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达. 即RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步.

第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）.

第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC).

RNAi途径主要存在于细胞浆中,但是siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置尚未明确.外源性（注射或喂养）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入细胞浆中的RNAi途径,仅在细胞浆中复制的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所抑制.外源性dsRNA则还可导致细胞核中的同源早期 RNA转录产物减少.

在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹dsRNA,进而可介导RNAi,这种dsRNA可能需要转移至胞浆中才可有效地沉默同源靶mRNA.

RNAi的放大效应机制

siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA,而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA.

新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA.次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程,进一步放大RNAi作用.这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）.

三、RNAi表达载体的构建

1. 目的基因的确定

（1）、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）

（2）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

（3）、http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com

2、设计siRNA靶序列

   在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物,比较有效的是长片段dsRNA.siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果.

（1）、选择siRNA靶位点：

   从转录AUG起始密码子开始,搜寻下游AA序列,记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点.有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效. Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结 合mRNA从而影响siRNA的效果.

（2）、序列同源性分析:

   将潜在的序列和相应的基因组数据库（人,或者小鼠,大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚,可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因,一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA.

通常来说,每个目标序列设计3—4对siRNAs,选择最有效的进行后续研究.

 （3）、设计阴性对照：

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性.通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱.当然,同样要保证它和其他基因没有同源性.

3、RNAi表达载体的选用

    化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内,但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的 RNAi效应持续时间短.针对这种情况,出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达.该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后,这样就能在体内表达所需的siRNA分子.这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA,能达到较长时间的基因沉默效果.

    通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列.选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,遇到4—5个连续的U即终止,非常精确.当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时,这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达,可抑制外源基因和内源基因.采用质粒的优点在于,通过siRNA表达质粒的选择标记,siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达.当然还有一点,那就是由于质粒可以复制扩增,相比起其它合成方法来说,这就能够显著降低制备siRNA的成本.

    此外,带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究,通过抗性辅助筛选,该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久.同时RNAi-Ready表达载体还能与逆转录病毒和腺病毒表达系统整合（BD Knockout RNAi Systems）,大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性,彻底克服某些细胞转染效率低的障碍,是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表 达的理想工具.

4、合成模板

   合成编码 shRNA的DNA 模板的两条单链,模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点,同时两端分别设计 BamH I 和 Hind III 酶切位点,可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间.

95℃,5min,缓慢退火, DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板

5、连接与转化

基本步骤：

（1）将100ul感受态细胞于冰上解冻.

（2）取5ul连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以 混匀内容物. 在冰上放置30分钟.

（3）将管放入预加温到42℃的水浴中,热激90秒.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2分钟.

（4）每管中加700ul LB培养基,37℃振荡培养1小时,进行复苏.

（5）室温4,000rpm离心5分钟,弃去上清后,用剩余100ul 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面.注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整.

（6）将平板置于室温直至液体被吸收.

（7）倒置平皿,于37℃培养,12~16小时后可出现菌落.

6、PCR鉴定和测序鉴定

在插入编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物,扩增片段在100-200bp之间.

7、特点

    siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久.即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于富集带质粒的细胞.这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题.

载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆,而且可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久,可以进行较长期研究 .

四、RNAi的前景展望
 

1、研究基因功能的新工具

    已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应.线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究.与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势,近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多,标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具.

2、研究信号传导通路的新途径

    联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关系, 证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好,克服了转

染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点, 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径.

3、开展基因治疗的新策略

    RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量增殖等作用,因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒.

    肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除.

   尽管目前RNAi技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段,但它在斑马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着RNAi将成为基因治疗中重要的组成部分,人工合成的dsRNA寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业.

编辑： viviank