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pCas9/gRNA1基因敲除载体对照实验

 

实验原理

pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子，由于不能有效地启动EGFP表达，pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据pTYNE载体的序列设计了pCas9/gRNA1对照阳性质粒pCas9-P，该质粒上的gRNA与pTYNE上EGFP编码区上游结合。pCas9-P表达的Cas9蛋白和gRNA组合现对pTYNE载体切割，经细胞修复后，突变的pTYNE将表达出读码框正确的EGFP蛋白，发出明亮的绿色荧光。




pCas9/gRNA1阳性对照载体（pCas9-P）靶序列：CTTCGAATTCTGCAGTCGA。该靶点位于pTYNE EGFP基因上游。

pCas9/gRNA1阴性对照载体（pCas9-N）靶序列：ATCGACTAGCCACTCAGAC。该序列为随机序列。

 

pCas9-P靶点在pTYNE载体上的位置:



 

Cas9切割原理:



 

实验内容

1、实验材料

pTYNE质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：CR1011）
pCas9 -N质粒（pCas9/gRNA1阴性对照，货号：CR1002，无内毒素试剂盒制备）
pCas9 - P质粒（pCas9/gRNA1阳性对照，货号：CR1002，无内毒素试剂盒制备）
Polyfect-C转染试剂（货号：P2011）
293T细胞系

 

2、实验步骤

1) 转染前24小时将293T铺到24孔板中。同时准备2个孔。

2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

组A	组B
pTYNE 0.4ug	pTYNE 0.4ug
pCas9 -N 0.4ug	pCas9 -P 0.4ug
DMEM培养基X ul	DMEM培养基 X ul
总体积50ul	总体积50ul

3) 准备转染试剂稀释液：

Polyfect-C转染试剂 3.2ul

DMEM培养基 96.8ul

4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。

5) 将转染液加入293T细胞。

6) 48小时后检测EGFP荧光表达。

 

实验结果