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TALEN的构建

 1、TALEN的构建

TALEN由四部分组成：N端序列，RVDs，C端序列，FokI。利用Type II 限制性内切酶可以将RVD模块分别生成不同的粘性末端，同时又不留有酶切位点，通过GoldenGate反应实现RVDs与TALEN骨架的无缝连接。

2、TALEN的蛋白质表达鉴定：TALEN构建成功后，将其质粒转染大鼠细胞系后，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，利用标签抗体进行western blotting检测其表达。

3、TALEN的体外活性检测

1）套峰检测

TALEN质粒转染大鼠细胞系，1~2天后提取细胞基因组DNA，PCR扩增靶位点序列，进行DNA测序，通过spacer区域出现套峰情况评价TALEN的活性。

2）错配酶检测

将靶序列PCR扩增子进行变性-退火，进行错配酶（MSDase）反应，将MSDase的消化产物进行电泳，通过比较切割条带与非切割条带的比例，即可反映出TALEN的活性高低。

4、受精卵注射及基因敲除大鼠的基因型鉴定

利用体外转录试剂盒将有活性的TALEN分别体外转录为mRNA后进行受精卵注射。将打靶的胚胎移植到代孕母鼠的输卵管，经过21-23天的孕育后F0代基因敲除大鼠出生，并进行基因型鉴定。