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哺乳动物细胞中通过RNA反式激活的条件性RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是治疗和研究应用中序列特异性基因敲除的有力工具。然而，需要对RNAi进行时空控制，以减少非特异性靶向、潜在毒性，并允许靶向必需基因。在本文中，我们描述了一类从头设计的RNA开关，其能够在哺乳动物细胞中对RNAi进行序列特异性调节。使用顺式抑制RNA元件，我们设计了RNA装置，该装置仅在与同源触发RNA结合时启动微小RNA生物发生。我们证明，这种条件性RNAi系统，称为触发RNA诱导的正交RNA干扰(ORIENTR)，在正交文库中激活后，人工miRNA生物合成增加了14倍。我们证明了ORIENTR触发器与dCas13d的集成将动态范围提高了31倍。我们进一步证明ORIENTR可以用于检测内源性RNA信号，并有条件地敲除内源性基因，从而实现调控的可能性，包括细胞类型特异性RNAi和通过RNA图谱重新构建转录网络。

多年来，RNAi一直被积极研究，并被证明是基础生物学研究和医学应用中靶基因敲除的有力工具1。RNAi可以通过递送siRNA(小干扰RNA)2或miRNAs(微小RNA)3来实现，通过转录后调节选择性沉默靶基因表达，而不干扰基因组。然而，组成型活性的、不受调控的RNAi有几个缺点，限制了潜在应用的范围。首先，递送的siRNA与内源性RNAi机制竞争，可能以有害的方式转移细胞资源4。第二，未调节的siRNA或miRNA的系统递送具有空间限制，并且非靶向细胞或组织中的RNAi活性可导致不良脱靶效应5。第三，缺乏时间调节的RNAi在需要诱导型基因敲除的特定应用中受到限制，以避免靶向必需基因时的致死效应或控制所需表型的发作和进展6，7，8，9。在过去的十年中，研究人员一直在寻求通过各种分子诱导剂，包括小分子核糖开关10，11，12，修饰的反义寡核苷酸13和小的合成RNA，以时间或基因座特异性的方式控制RNAi活性。

RNA开关技术在将RNA输入信号转换为RNAi输出信号方面具有很大的前景，作为精确调节感兴趣基因活性的手段。RNA的高度可编程性和结构可预测性使自动从头设计成为可能，用于构建具有与内源性生物途径接口潜力的传感元件和逻辑电路16，17，18。近年来，RNA开关技术已经成功地应用于哺乳动物细胞中来上调转基因活性。例如，eToeholds通过调节内部核糖体进入位点(IRESs)19的RNA结构实现了RNA特异性转基因翻译激活。几项研究已经建立了可编程的RNA传感依赖的蛋白质翻译技术，其中特定的RNA碱基配对基序招募ADARs来编辑RNA以进行转基因翻译激活20，21，22。然而，通过可编程的RNA开关技术下调哺乳动物细胞中的内源基因在很大程度上仍未被探索，尽管在许多潜在的应用中需要条件性基因沉默。

为了在哺乳动物细胞中开发可由细胞RNA调节的条件性RNAi，我们仔细研究了干扰RNA底物和RNAi途径中必需酶之间的分子识别的可能性。在经典途径中，miRNA生物发生在细胞核中由微处理器复合物启动，该复合物由核RNase III Drosha和两个DGCR8蛋白作为辅因子组成。微处理器搜索RNA转录物以识别和切割初级(pri-)mirna，释放发夹状前体(pre-)mirna，然后输出到细胞质中，进一步被Dicer切割成成熟miRNA24，25。微处理器和Dicer都通过保守的RNA基序和特定的二级结构识别底物RNA，从而提供了通过破坏微处理器或Dicer识别元件来调节底物RNA可及性的机会26，27，28。先前有条件地调节RNAi活性的努力集中在Dicer底物RNA形成上14，15；然而，Dicer底物RNA需要具有5ʹ磷酸和3ʹ 2-nt突出端的特征性双链RNA螺旋末端27，28。这些结构要求使得整合底物激活的顺式调控元件具有挑战性。迄今为止，Dicer基于底物的RNA转导系统仅在试管14和细胞裂解物15中使用了反式作用RNA分子，尚未在活细胞中证实。

在此，我们报告了一个条件性RNAi系统，它在哺乳动物细胞中功能强大，并通过利用顺式调节RNA元件控制微处理器的识别来响应特定的RNA刺激。这个系统，我们称之为触发RNA诱导的正交RNA干扰(ORIENTR)，由一个条件性pri-miRNA组成，它需要结合一个同源的触发RNA来形成一个主动的微处理器底物，该底物又可以被加工成一个人工miRNA (amiRNA ),用于诱导靶基因抑制。在缺乏触发RNA的情况下，条件性pri-miRNA采用非活性二级结构，阻止微处理器识别。我们探索了功能性pri-miRNA支架的序列和结构要求，并确定了人类细胞中的功能性正交定向装置。我们进一步利用失活的CRISPR核酸酶dCas13d来保护触发RNA免于降解，并增加RNA核定位以提高性能。重要的是，定向子将传感器区域中的触发RNA序列与致动器区域中的输出amiRNA序列完全解耦，使得任意的RNA输入可以用于沉默任何所需的mRNA。事实上，我们能够使用ORIENTR来感知环境胁迫下内源性mRNA表达的波动，并有条件地触发靶向内源性基因的amiRNA生物发生。因此，我们的方法证明了在哺乳动物细胞中建立可编程条件RNAi合成电路的重要一步。

原文：Conditional RNA interference in mammalian cells via RNA transactivation | Nature Communications