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【文献速递】CRISPR PLUS: Cas9嵌合融合蛋白增强的基因组编辑效率

摘要

改善CRISPR-Cas9基因组编辑系统以降低脱靶效应的努力主要是以牺牲其强大的靶上效率为代价的。为了提高准确性和效率，我们创建了与5’至3’核酸外切酶重组J (RecJ)或GFP融合的嵌合SpyCas9蛋白，并证明了将两种嵌合蛋白的预组装核糖核蛋白转染到人或植物细胞中导致更高的靶向诱变效率，高达600%，而脱靶效应没有显著增加。两种融合蛋白活性的提高应该能够编辑以前难以编辑的基因，从而容易获得具有设计特征的细胞。

介绍

成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关9 (Cas9)构成了在细菌、古细菌和噬菌体中发现的适应性免疫系统1，2，3，但由于其可编程性和易用性，CRISPR-Cas9已被重新用于各种应用中的基因组编辑，包括研究、治疗、微生物组操作和农业4，5，6，7，8。

在CRISPR-Cas9系统中，功能性RNA-Cas9复合物由作为DNA裂解酶的Cas9效应蛋白和两个单链指导RNA组成，即反式作用CRISPR RNA (tracrRNA)和CRISPR RNA (crRNA)，它们将复合物导向靶序列。RNA-Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物分两步定位于其靶序列；它首先定位并结合到非靶链的原间隔区相邻基序(PAM)(cas 9的5′-NGG-3′)，然后解开靶DNA以在crRNA和基因组中原间隔区序列的靶链之间互补结合。在真核细胞中，由Cas9 RNP在靶DNA中产生的dsDNA断裂(DSB)通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)进行修复9。易错的NHEJ过程可以在靶位点产生长度可变的插入和/或缺失(indel)突变，而HDR介导的修复可以在单链或双链DNA供体模板的帮助下取代DNA序列。

自2012年首次展示以来，来自化脓性链球菌(SpyCas9)的Cas9蛋白已被广泛表征并开发出各种应用10。SpyCas9 RNP作用模式的各个步骤已经被确定为改进的目标，包括与PAM、非靶链和crRNA相互作用的结构域的蛋白质工程，这使得特异性得以提高11；此外，为了稳定性而对指导RNA进行的化学修饰提高了SpyCas9的功能12。然而，提高效率的努力相对无人问津。酶动力学既受酶与底物结合形成酶-产物(EP)复合物的速度的影响，也受酶从EP复合物分离并撞击另一种底物的速度的影响11。与传统的酶不同，SpyCas9 RNP和原间隔区DNA之间能量稳定的复合物使RNA蛋白质-DNA三元结构难以解离，这一特性使Cas9成为一种不遵循传统米氏和门滕动力学的单周转酶13。

为了增强SpyCas9的酶活性，包括核酸内切酶、核酸外切酶、连接酶抑制剂、脱氨酶和RNA逆转录酶在内的各种蛋白质已经翻译融合到SpyCas9蛋白质上。当大肠杆菌3’至5’核酸外切酶I (sbcB)融合到SpyCas9时，相对于单独的SpyCas9，嵌合蛋白在斑马鱼中产生更长的DNA缺失14。此外，据报道，SpyCas9嵌合融合蛋白与三引物修复核酸外切酶2 (TREX2)(一种参与DNA修复、复制和重组的人类3’至5’核酸外切酶)可提高诱变效率15，16。文本(将核酸外切酶T5与FnCas12a结合)——融合策略显著增加了FnCas12a在不同人类细胞系中多个基因组位点的敲除效率17。在敲入活性的情况下，当人CtIP核酸内切酶与SpyCas9融合时，相对于单独的SpyCas9主链蛋白，嵌合蛋白导致转基因整合效率增加两倍以上18。53BP1的显性负突变DN1S融合到Cas9，Cas9-DN1S融合蛋白显著阻断NHEJ事件，特别是在Cas9切割位点，并提高HDR频率19。Rad52-Cas9融合策略在人HEK293T细胞的替代报告基因检测中使HDR增加了约3倍20。此外，腺嘌呤或胞苷脱氨酶与核酸酶失活版本的SpyCas9的嵌合融合导致没有DSB的碱基编辑，同时减少了非预期的脱靶效应21，22。最后，融合到催化受损的SpyCas9和主要编辑指导RNA (pegRNA)的工程逆转录酶导致使用pegRNA作为修复模板的特定碱基变化23。

因为具有SpyCas9的嵌合融合蛋白显示出拓宽了位点特异性核酸酶SpyCas9的能力范围。我们试图测试可能削弱嵌合蛋白与底物DNA结合能的辅助蛋白，从而增加周转率，最终提高基因组编辑效率。为此，我们首先创建了融合蛋白，其中SpyCas9的羧基端与一种DNA修饰蛋白相连，该蛋白可以是5’至3’DNA核酸外切酶(RecE、RecJ、T5或lambda)24、绿豆核酸酶或末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。据报道，T5和RecJ核酸外切酶增强FnCas12a，T5-FnCas12a在不同人类细胞系的多个基因组座位上增加FnCas12a的敲除效率，而RecJ-FnCas12a降低FnCas12a17的敲除效率。 绿色荧光蛋白(GFP)也作为对照进行测试。在测试的七个中，SpyCas9与RecJ (SpyCas9-RecJ，C9R)以及令人惊讶地与GFP (SpyCas9-GFP，C9G)的融合导致诱变和敲入效率的显著增加，而脱靶效应相对于单独的SpyCas9 (C9)结构没有显著增加。我们将C9R和C9G这两种功能增强的融合蛋白称为CRISPR PLUS，并探索它们在不同条件下编辑DNA的效率，例如在试管、培养的细胞系、原代人类细胞和植物原生质体中。

结论

总之，我们已经表明，CRISPR PLUS大大提高了基因组编辑效率，同时相对于C9对照保持了较低的脱靶效应。测试了人类HEK293T细胞中的三个基因、iPSCs中的四个基因和植物细胞中的一个基因，并一致显示CRISPR PLUS超过了C9的编辑效率。鉴于脱靶效应与处理细胞中基因组编辑酶的持续时间和浓度成比例11，CRISPR PLUS将进一步降低脱靶效应的可能性，因为CRISPR PLUS在较短的时间内实现了基因组编辑速率，浓度相对低于C9。当实施多重基因组编辑时，更高的效率也是有用的，因为在多个基因座同时具有纯合等位基因的可能性等于在单个基因座的编辑率的乘积。我们的结果应该代表了用于治疗的珍贵和难以编辑的细胞的多重基因组编辑的突破性技术，并加快了再生药物的可用性。

https://www.nature.com/articles/s41598-021-95406-8