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【文献速递】通过使用实时控制方法将细胞保持在最佳分泌应激水平来最大化蛋白质产量

摘要

优化重组蛋白的生产是一个重要的工业和制药问题。宿主细胞对蛋白质的分泌大大简化了下游的纯化过程。然而，对于许多蛋白质来说，这也是限制生产的步骤。目前的解决方案包括对底盘细胞进行广泛的工程改造，以促进蛋白质运输，并限制由过度分泌相关压力引发的蛋白质降解。在这里，我们提出了一个基于调节的策略，在这个策略中，诱导是基于细胞当前的压力水平动态调整到最佳强度的。使用少量难以分泌的蛋白质、基于生物反应器的自动细胞计量平台和量化分泌蛋白质水平的系统分析，我们证明了分泌最佳点是由细胞亚群的出现来指示的，这些细胞亚群积累大量蛋白质、降低生长并面临显著压力，即经历分泌耗尽。在这些细胞中，适应能力被过于强大的生产所淹没。使用这些概念，我们表明，对于单链抗体可变片段，通过使用实时闭环控制将细胞群动态保持在最佳应激水平，分泌水平可以提高70%。

介绍

生物生产是一个具有重大经济意义的领域，预计将在更可持续的产业发展中发挥重要作用1，2。生物制品包括各种化学物质，如酒精、有机酸、香料、抗生素，以及各种工业或药物蛋白质，如酶和抗体3，4。酵母广泛用于异源蛋白质生产。它们种植成本低廉，易于改造，并具有延长的蛋白质分泌能力5。这最后一个特征非常重要，因为分泌感兴趣的蛋白质(POI)极大地促进了下游过程和产物纯化。然而，蛋白质分泌是一个复杂的多阶段过程。前导肽作为蛋白质从胞质溶胶向内质网(er)转运的信号。在那里，蛋白质被折叠并经历翻译后修饰和质量控制，然后被运输到高尔基体并最终被分泌6，7。瓶颈可能出现在不同的阶段3、8、9、10、11。分泌压力触发各种适应机制的激活。未折叠蛋白反应(UPR)通过调节数百种基因的表达起着关键作用12，13，14。它的作用是双重的。一方面，它通过调节与易位、折叠、蛋白质成熟或分泌相关的基因来增加运输能力12，15。另一方面，它会触发针对累积蛋白质的降解机制，如内质网相关蛋白质降解(ERAD)16，17，内质网吞噬18，19或内质网回流20，21。重要的研究工作集中在寻找底盘细胞的遗传修饰，以增加运输能力或减轻蛋白质降解3，8，9，10，11。不幸的是，这些遗传修饰通常是底盘和蛋白质特异性的，因此，它们在酵母中的鉴定和实施需要大量的努力。

在这项研究中，我们提出了一个完全不同的策略。我们的目的是确定诱导最佳点，即蛋白质分泌最大的最低诱导水平，利用有利于分泌的适应机制，避免有害的机制。我们证明，在酿酒酵母中，诱导甜区是由细胞亚群的出现所指示的，这些细胞亚群积累了大量的蛋白质，降低了生长，并面临显著的压力，即经历了分泌耗竭。在这些细胞中，适应能力被过于强大的生产所淹没，正如通过观察适应缺陷型菌株(HAC1敲除)所证明的那样，当分泌易于分泌的蛋白质时，它们呈现相同的标志性表型。高于这一水平，生产需求的进一步增加与蛋白质降解的增加相关，导致分泌的蛋白质水平相似或更低。最后，我们表明，通过使用实时闭环控制将细胞群体动态保持在最佳应激水平，分泌水平可以提高70%。为了获得这些结果，我们结合了两种创新方法。首先，我们使用一小批表达各种难以分泌的poi的工程酵母菌株，其诱导水平可以使用光响应性启动子精确控制，其分泌水平可以使用磁性免疫珠以系统的方式定量，以及它们的UPR分泌应激的荧光报告基因。第二，我们使用基于自动浊度仪的平台和自动细胞仪，允许在延长的持续时间内以高时间分辨率对八个不同的条件并行进行单细胞测量。迄今为止，这项工作为生产需求、分泌压力和有效分泌水平之间的相互作用提供了最全面的定量观点。此外，我们在这里提出的调节策略是通用的，因为它适用于任何分泌的蛋白质，并且与经典的底盘工程策略互补。

讨论

我们证明了对难以分泌的蛋白质存在非平凡的最佳需求水平。这些诱导甜区是蛋白质和条件依赖的。将对蛋白质生产的需求增加到超过这些水平会导致对没有更多或甚至更少分泌蛋白质的细胞施加更大的压力。它还伴随着细胞群体的瞬时双峰反应的令人惊讶的出现，其中一部分细胞积累了大量的蛋白质，降低了生长，并面临显著的压力，即经历了分泌耗竭。当生产需求达到细胞的最大运输能力并且适应反应太弱或太慢时，观察到蓄电池的标记表型。在群体中观察到的蓄积细胞的最大比例在细胞群体水平上量化了分泌负荷的影响。我们还表明，在分泌耗尽的情况下，细胞适应很大程度上，如果不是唯一的，是通过UPR反应介导的。使用定量分析，我们发现当蓄电池出现时，主细胞群(非蓄电池)中的蛋白质降解率开始增加。因此，蓄电池的存在是反映群体效应的单细胞现象。鉴于累加器表型不仅在内部POI水平中可见，而且在UPR应激水平中也可见，我们测试了一种调节策略，其中首先我们确定了UPR累加器出现的诱导水平，其次，我们使用实时控制将细胞群维持在该应激水平附近。使用这种策略，我们获得了比最大诱导策略高70%的分泌蛋白水平。我们的对照实验集中于分泌scFv的细胞，因为这些细胞在中等诱导水平下获得最高分泌水平。因为我们在这项工作中测试的其他蛋白质没有这种特征，所以我们不期望在优化其他蛋白质的分泌方面获得显著的益处。我们还注意到，精心选择的开环控制策略可能比我们展示的闭环控制实验表现得同样好。建立这种开环策略相当于通过试验和错误找到触发压力的诱导水平，该压力接近我们闭环控制实验中使用的目标压力水平。闭环控制策略的使用是开环控制的这种试错法的替代方法。因此，闭环控制策略可能更节省时间。此外，诱导和分泌应激之间的关系是蛋白质依赖性和培养基依赖性的。我们预计，尽管我们没有证明，闭环控制策略比基于开环控制的策略提供了更加通用和稳健的解决方案。最后，我们强调，我们在这里提出的调控策略，基于细胞分泌应激水平的实时测量，原则上适用于任何要分泌的蛋白质，并与经典的底盘工程策略互补。它只需要向细胞中加入分泌应激水平报告基因。不需要对分泌的蛋白质进行修饰。

两种成分的结合使用有助于获得这些结果。第一个是设计和构建一个小的菌株集合，对于一系列不同分泌复杂性的蛋白质和一系列诱导水平，允许方便地量化目标蛋白质的内部水平、分泌应激水平、细胞生长率和培养基中的蛋白质分泌水平。第二种是使用光基因启动的生物反应器装置，具有自动取样和细胞计量测量。该设置允许以高时间分辨率获得8个平行培养物的单细胞测量值和生长率测量值，并持续更长时间。我们还利用磁性免疫珠分析对一组蛋白质的分泌水平进行了系统测量。

自然，我们不是第一个报道诱导甜区存在的人。这是一个众所周知的事实。然而，通过结合合成生物学和实验室自动化方法，我们在这里提供了关于酵母中蛋白质分泌的最全面的定量观点。此外，我们确定了一个令人惊讶的瞬态双峰反应的细胞与特定的倦怠状态，并证明了其相关性的最佳诱导水平的确定。重要的是，我们提出的调控策略是基于细胞中平均UPR应激水平的简单测量，因此可以独立于特定的遗传背景而应用。特别是，它原则上与工业应用中广泛的底盘工程优化策略兼容并互补。我们注意到，酵母中分泌相关特征的双峰分布已经在之前使用微流体平台的工作中描述过45。然而，它们对于优化蛋白质生产的意义没有被讨论。最后，这项工作还表明，网络遗传方法可以有效地用于优化感兴趣的细胞过程。到目前为止，已经提供了许多关于网络基因方法的定量调节能力的概念的证据(例如，参考文献。46,47,48,49,50,51,52).然而，只有少数作品证明，由于实时控制策略，某些感兴趣的过程实际上可以得到改善53，54。有趣的是，Benisch和他的同事在最近的出版物中提出了一个密切相关的工作55。具体来说，他们观察到，使用光遗传实时控制方法，将细胞UPR应激保持在中等水平，可以获得更高水平的分泌型α-淀粉酶。这不是我们在这项研究中观察到的。在我们的病例中，我们没有观察到明显的分泌缺陷，但我们确实观察到α-淀粉酶在高诱导水平下有明显的短暂生长缺陷。这种差异可能是由于实验设置的差异。Benisch和他的同事以分批模式使用1升生物反应器，并采用两阶段控制策略，其中实时控制阶段使用24小时，随后是持续到70小时的完全诱导阶段，此时测量淀粉酶活性。因此，在实验结束时测量的中间诱导水平的最高分泌水平可能源于更规则的生长，而不是改善的分泌。事实上，在批量生物反应器55中，24小时的全光诱导导致光密度下降10倍。观察到的差异也可能源于菌株和基因结构不完全相同的事实。此外，Benisch和他的同事像我们一样观察到了细胞中应力水平作为时间函数的非单调行为。在他们的情况下，这种行为可以通过一个复杂的常微分方程模型(10个状态变量，26个参数)来解释，而我们可以通过细胞在分泌耗尽时的短暂存在来解释。

未来工作的第一个显而易见的方向是研究一群细胞对蛋白质生产和分泌的强烈需求的双峰反应的机制起源。观察到的差异很可能来源于细胞能力的预先存在的差异，一旦蛋白质开始在分泌途径中积累，就激活蛋白质降解。然而，分子机制仍有待阐明。未来工作的第二个方向是设计和构建遗传回路，使反馈回路内在化，以便每个细胞根据自己的压力水平调整对外部需求的反应。此类监管策略已经在不同的情况下提出56，57，58。关于分泌优化，识别可适当用于关闭调节环的应激反应启动子仍然是一个挑战。最近对分泌应激的新型生物传感器的表征将提供一个良好的起点59。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38807-9