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【文献速递】具有增强的活性和热稳定性的萤火虫荧光素酶突变体

分离自萤火虫萤火虫(Ppy)的荧光素酶催化两步反应，导致d-荧光素的氧化，伴随着峰值在560 nm的黄色-绿色光的发射。在许多应用中，Ppy荧光素酶已被广泛用作活细胞和生物体中的报告基因。然而，荧光素酶的低稳定性和有限的细胞内荧光素浓度限制了一些生物应用。为了应对这些挑战，对Ppy荧光素酶进行蛋白质工程改造的努力已经产生了许多具有改善的性质如热稳定性、pH耐受性和催化转化的突变体。在这项工作中，我们将显示增强酶热稳定性的氨基酸突变(突变体E)与报道的增强催化活性的氨基酸突变(LGR)结合起来。所得突变体(YY5)含有野生型荧光素酶的八个氨基酸变化，并在低荧光素浓度下表现出改善的热稳定性和更亮的发光。因此，YY5可用于报告基因的应用。

多年来，荧光素酶已被设计用于化学和生物学中的各种应用。11特别是，Ppy荧光素酶仍然是生物成像应用中最受欢迎的生物发光报告基因。然而，对Ppy荧光素酶的大多数蛋白质工程努力都集中在改善或改变特定的性质，例如，热稳定性、发射光谱或催化活性。赋予不同特征的突变组合可以进一步增强荧光素酶在报道基因应用中的实际效用。例如，Branchini等人将一组热稳定化突变整合到Ppy荧光素酶的颜色突变体中

我们的目标是构建一种萤火虫荧光素酶突变体，它具有更高的活性(更低的Km和更高的kcat值)和更高的热稳定性，结合了以前报道的每种性质的突变的特征。通过对野生型和变体(LGR、突变体E和YY5)的体外生物化学分析，我们证明了新的突变体YY5在低d-荧光素浓度下显示出提高的发光活性。由于已经表明d-荧光素的低细胞渗透性是萤火虫荧光素酶生物成像应用中的一个限制因素，YY5可用于这种应用。