微信扫一扫

下载说明书

在线询价

【文献速递】用于组成型慢病毒载体生产的新型稳定细胞系

摘要

慢病毒载体是促进基因转移和稳定基因表达的良好工具。它们的潜力已经在基因疗法治疗各种疾病的临床试验中得到证明。对于大规模的LV生产，稳定的生产者系统是理想的，因为它允许可扩展的和成本有效的病毒生产，具有增加的可重复性和安全性。然而，稳定系统的开发具有挑战性且耗时，主要限制在于选择呈现高表达水平Gag-Pro-Pol多蛋白的细胞以及与一些病毒成分相关的细胞毒性。在此描述了使用突变的活性较低的病毒蛋白酶建立新的LV生产细胞系，以克服潜在的细胞毒性限制。双顺反子表达盒的稳定转染以及翻译机制的重新启动使得能够产生支持高滴度的LentiPro26包装群体。此外，通过跳过中间克隆筛选步骤并仅进行一次最终克隆筛选，有可能节省时间并在不到6个月的时间内产生组成型产生滴度超过106 tu . ml-1 . day-1的LentiPro26-A59细胞系。这项工作是朝着开发改良的LV生产细胞系前进了一步，旨在有效地提供临床扩展的基因治疗应用。

介绍

慢病毒载体(LVs)是体内和体外基因转移的重要工具，因为它们能够永久整合到分裂和非分裂细胞的细胞基因组中，维持长期稳定的表达。自20世纪90年代初首次开发LV以来，LV在安全性和有效性方面得到了改善1；值得注意的是第三代包装系统2和自失活(SIN)载体3，4的发展。据报道，与它们的简单对应物γ-逆转录病毒载体(γ-RVs)相比，LVs也表现出较低的遗传毒性5，6。这些原因证明了越来越多的基于LV的基因治疗研究进入临床试验7，在治疗神经退行性或遗传性疾病、传染病以及最近的癌症免疫治疗方面取得了有希望的结果8，9。最近，美国美国食品药品监督管理局批准了第一个使用LVs的基因疗法，即tisagenlecleucel(以KYMRIAH上市)。这种治疗使用SIN-LV来修饰自体T细胞并治疗B细胞急性淋巴细胞白血病。

tisagenlecleucel的批准标志着LVs进入基因治疗领域的临床-市场过渡，预计需要大规模生产临床级LV制剂。传统上，LVs的生产依赖于用四种表达盒瞬时共转染HEK293T细胞:(I)编码病毒结构蛋白和酶的Gag-Pro-Pol；(ii) Rev，编码在病毒基因组核输出中起重要作用的Rev辅助蛋白；(iii)包膜，编码与靶细胞受体相互作用以介导病毒细胞进入的糖蛋白；和(iv)载体基因组，携带待包装到生产的病毒颗粒中的目的基因。瞬态低压生产易于在小规模下进行。然而，短暂的低压生产很难扩大规模。另外的缺点包括高质量可转染DNA和转染试剂的高成本、批与批之间的显著差异和短的生产周期10。在这种情况下，非常需要稳定的组成型生产高滴度LV的LV细胞系。然而，这种细胞系的产生具有挑战性且耗时，需要几个转导/转染和选择步骤，所有这些步骤都与克隆分离、扩增和筛选相结合，以找到最佳的LV生产克隆。此外，水泡性口炎病毒(VSV-G)包膜(假型LV最常用的包膜)的HIV-1蛋白酶和糖蛋白的细胞毒性阻碍了稳定LV生产细胞系的建立1。

为了解决细胞毒性问题，已经开发了具有表达病毒成分的诱导系统的细胞系10。然而，当使用这些可诱导的细胞系时，LV的产生在诱导后仅维持很短的时间，并且可能需要额外的纯化步骤来去除诱导剂10。迄今为止，仅报道了三种组成型表达所有LV成分(Gag-Pro-Pol、REV、包膜和载体基因组)的细胞系。在所有情况下，选择具有稳定和高表达Gag-Pro-Pol的克隆似乎是主要的挑战，难以仅通过传统的质粒细胞转染来开发稳定的高滴度LV生产细胞系。为了克服表达限制，开发了几种策略，使用病毒载体将LV组分引入细胞基因组，促进它们的高表达，并促进产生高LV滴度的克隆的建立。STAR衍生细胞系11是第一个建立的LV生产细胞系。在其发展过程中，γ-RVs被用于将gag-pro-pol密码子优化的和rev表达盒整合到HEK293T细胞的基因组中。剩余的LV成分通过质粒细胞转染导入。STAR的建立证明了有可能开发出组成型支持高LV生产力的细胞系。然而，STAR细胞系开发中使用的γ-RVs的长末端重复序列(LTRs)和包装序列(ψ)存在于LV生产细胞的基因组中，这可能会促进具有复制能力的慢病毒(RCL)的产生，从而引起安全性问题12。几年后，使用重组杂交杆状-AAV载体成功地将gag-pro-pol和rev基因整合到细胞基因组中，避免了γ-RVs13的使用，开发了RD2-MolPack-Chim3 LV生产细胞系。使用SIN-LVs引入Tat和包膜基因，以最小化可能的安全性问题14，15。后期特异性分析证明了RD2-MolPack-Chim3细胞系的安全性13。最近，在WinPac衍生的细胞系开发中，一种不同的方法使用γ-RVs将报道基因表达盒整合到细胞基因组中，以鉴定支持高报道基因表达水平的克隆16。随后，通过Cre重组酶介导的盒交换(RMCE ),用含有密码子优化的LV gag-pro-pol序列的新盒替换该报道基因表达盒。通过传统的质粒细胞转染引入剩余的LV组分。在盒子交换过程中去除大部分γ-RV序列降低了RCL形成的风险。然而，RMCE的使用需要额外的克隆分离和筛选步骤，使得细胞系的发展更加漫长和费力。

提到的所有三种LV生产细胞系反映了对改进的稳定LV生产系统的积极需求。本文描述了加速建立呈现高滴度的LV生产细胞系的替代方法，在整个细胞系发育过程中，仅通过使用化学转染和抗生素选择步骤。

图1

本研究中使用的表达盒的示意图。(a) Gag-Pro-Pol表达盒。(b) Rev表达盒。(c)包膜表达盒。(d) LV基因组表达盒。缩写:CMV，巨细胞病毒启动子；Int，内含子；GPP，gag-pro-pol序列；潘，波利亚序列；具有突变的T26S蛋白酶序列的GP(T26S)P、gag-pro-pol；BlastR，杀稻瘟素抗性基因；劳斯肉瘤病毒启动子；潮霉素抗性基因；WPRE，土拨鼠肝炎转录后调控元件；VSV-G，水泡性口炎病毒的糖蛋白G；SV40/FerH，与SV40增强子融合的铁蛋白重链(FerH)启动子；IRES，内部核糖体进入位点；ZeoR，zeocin抗性基因；ψ，打包信号序列；hPGK，人磷酸甘油酸激酶启动子；嘌呤霉素抗性基因。较细的灰色箭头代表mRNA转录物。实心灰框代表驱动翻译机制重新启动的间隔区。

图2

转染HEK293T细胞产生瞬时左心室。(a)使用野生型或突变的T26S蛋白酶，用VSV-G或双嗜性包膜假型化的LV的瞬时生产滴度比较。(b)Gag-Pro(T26S)-Pol表达盒的瞬时LV生产滴度比较。(Rev表达盒的瞬时LV生产滴度比较。(d)载体基因组表达盒的瞬时LV生产滴度比较。(+)表示转染混合物中存在，而()表示不存在相应的质粒。显示的数据代表3次独立实验的平均标准偏差。*(p < 0.05)和**(p < 0.005)由单尾不成对t检验给出。

讨论

这项工作描述了HIV-1衍生的LV生产细胞系的发展过程，该细胞系仅基于病毒构建体的化学转染，表现出超过106 tu . ml-1 . day-1的稳定病毒生产力。此处使用的质粒来自于Dull等，2中描述的第三代系统，保持gag-pro-pol/rev裂解盒方法并保持载体基因组的自失活设计。此外，除了载体基因组表达盒，没有进一步的逆转录病毒LTRs或ψ序列用于提高安全性标准。

为了最小化与病毒蛋白酶活性相关的潜在细胞毒性问题，使用了含有活性较低的T26S突变蛋白酶17的Gag-Pro-Pol构建体。这种策略可以支持建立更健壮的细胞系，可能允许更高水平的gag-pro-pol表达，据报道这是开发高滴度LV生产细胞系的主要限制之一11，13，16。

关于包膜糖蛋白，尽管VSV-G假型LVs的滴度较高(图2a)，但其细胞毒性不允许其组成型表达10。无毒的MLV两性信封被用作概念证明。其它无毒包膜糖蛋白可以组成型表达为假型LV，例如来自长臂猿白血病病毒(GaLV)31或来自猫内源性逆转录病毒(RD114)13，31的修饰糖蛋白。 为了指导表达高水平LV成分的细胞的选择，使用翻译机制或IRES的重新启动将不同选择性标记的表达与LV成分的表达紧密偶联(图1)。在Gag-Pro-Pol表达盒的特定情况下，Gag-Pro-Pol相对于Gag多蛋白32，33的较低核糖体翻译速率，与间隔区18，19(选择性标记)后的基因翻译效率降低相关，驱动高严格选择过程，并因此促进选择间隔区上游基因(病毒成分)具有高表达水平的细胞。

首先用Gag-Pro(T26)-Pol，其次用Rev表达盒对HEK293T细胞进行顺序PEI转染和抗生素选择，允许建立LentiPro26包装群体。通过用SIN载体基因组和VSV-G或双嗜性包膜表达盒转染LentiPro26细胞(图3b)，半稳定LV产物产生的滴度类似于或甚至高于通过其它报道的包装细胞系PK-7(4×106 tu . ml-1 . day-1)13和win pack-57r 10(3×105 tu . ml-1 . day-1)16的半稳定转染获得的滴度，这证明了质粒转染后对组成型Gag-Pro(T26S)进行抗生素选择过程的潜力具有双嗜性包膜的LentiPro26群体的稳定转染允许选择包装群体LentiPro26-4070A，当用SIN载体基因组质粒瞬时转染时，其能够产生7×105 tu . ml-1 . day-1(图3b)。使用其亲代群体LentiPro26在以前的半稳定LV生产中获得了相同的滴度，表明在LentiPro26-4070A群体中双嗜性包膜的稳定表达不限制病毒生产。

除了Gag-Pro-Pol，载体基因组的更高表达水平可能对维持高滴度也很重要。这是稳定的γ-RV生产细胞系22，34的情况。为了改进对具有载体基因组高表达水平的细胞的选择，在嵌合LTR-RSV启动子的控制下，将选择性标记基因(嘌呤霉素)的表达与报道基因(mCherry)的表达相结合(图1d)；翻译机制的重新启动也被用于确保表达高mCherry水平的细胞的严格选择。使用这种新的载体基因组设计，mCherry表达与载体基因组转录物的表达直接相关，该转录物将被包裹在产生的新LVs中。基于mCherry强度，通过荧光激活细胞分选分离载体基因组高表达水平的克隆。该策略被证明是成功的，因为分离的10个顶级克隆中的9个递送的体积滴度在跨实验比较时似乎优于亲代群体(图3d和4b)。表现出较高LV生产力的克隆，命名为LentiPro26-A59，支持接近2×106 tu . ml-1 . day-1的滴度，当跨实验比较时，产生比亲代群体多约10倍的LV(图3d和4b)。这些LV包装群体和LV生产细胞系是概念证明，本研究中开发的策略可用于在更短时间内产生LV生产细胞系。此外，证明了仅通过传统的转染和随后的抗生素选择过程就可能产生相对高滴度的LV生产细胞。Gag-Pro-Pol、Rev和包膜表达盒中缺乏逆转录病毒LTRs和ψ序列也可能有助于更安全的细胞系分布。其它方法如RMCE35，36，37，密码子优化11，16，串联阵列25或其它方法可用于建立新的改良的和更安全的高滴度LV生产细胞系。此外，对LV组分表达水平、LV制剂质量、LV自体转移的可能性的全面表征，以及对RCL形成和LV基因动员的仔细分析，对于进一步表征新的LentiPro26衍生的细胞系是重要的。

从单个培养物或甚至连续生产中进行多次上清液收获的可能性是稳定的LV生产者系统的主要优点，由于其短的半衰期而减少了LV衰变38，39，因此，使其成为产生更高感染性的更具成本效益的生产过程。通过将LentiPro26-A59稳定生产的“体积/生长面积”比值从0.1操纵至0.4 mL/cm2，我们能够增加细胞生产率并延长培养时间，导致累积滴度增加超过10倍(图5d)。我们通过在培养基中加入丁酸钠进一步提高了体积滴度。丁酸钠是哺乳动物细胞中众所周知的组蛋白脱乙酰酶抑制剂；通过阻止DNA压缩，它改善了mRNA转录，同时也改善了蛋白质生产40。尽管在短期生产期间LV产量有少量增加，丁酸钠的存在削弱了长期培养中的病毒产量(图6d)。Sakoda及其同事也报道了类似的观察结果，41其中丁酸钠延长细胞处理降低了左心室生成。对病毒生产能力有更直接影响的其他补充剂或代谢工程方法也可用于进一步增加左心室生产42，43，44。 LV生产随时间的稳定性和大规模病毒生产的可再现性是稳定LV生产细胞系的商业和临床成功实施的决定性因素。LentiPro26-A59细胞系在不存在抗生素的情况下显示出持续近一个月的LV产生，在存在抗生素的情况下显示出持续至少两个月的LV产生。此外，通过接种单个HYPERFlask，收获了总共3.4 L平均滴度为1 × 106 TU/mL的上清液。这些结果验证了LentiPro26-A59细胞系的可重复性和可扩展性，证明了其适应连续大规模生产系统的潜力。 已知哺乳动物细胞中异源基因的几种沉默机制损害蛋白质生产45，46。LentiPro26-A59病毒生产力随时间下降的一个可能解释是Gag-Pro(T26S)-Pol表达盒中CMV启动子47的表观遗传沉默。随着时间的推移，进一步分析每种LV组分的表达水平和细胞基因组中各自的拷贝数，可能有助于理解和找到避免病毒生产力随时间损失的解决方案。 本研究中使用的理性策略大大降低了复杂性，并加速了持续生产LVs的潜在更安全细胞系的产生过程，使其类似于γ-RV生产细胞系建立过程48。密码子使用、病毒包膜糖蛋白和培养条件的进一步优化甚至可能增加LV的生产率和安全性，从而产生有竞争力的LV生产细胞系以满足基因治疗临床应用的需求。

https://www.nature.com/articles/s41598-018-23593-y