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【文献速递】一种用于工程细胞因子产品生物活性评价的通用报告细胞系

工程细胞因子产品代表了一类不断增长的治疗性蛋白质，需要在药物开发的不同阶段测试其生物活性。在大多数情况下，为不同的产品建立专门的生物检测，这一过程可能既费时又麻烦。在这里，我们描述了各种免疫调节蛋白的通用细胞报告系统的开发和实施。该新系统利用了以下事实:各种类型的促炎剂(例如，细胞因子、趋化因子、Toll样受体激动剂)的信号传递可能涉及NF-κB的转录激活。使用病毒转导，我们产生了B或T淋巴细胞来源的稳定转化细胞系，并将新的报告细胞系与常规生物测定进行了比较。对各种白细胞介素和TNF超家族成员的实验发现表明，新开发的“通用”生物测定方法产生的生物活性数据可与专用常规方法获得的数据相媲美。具有NF-κB报告基因的工程细胞系用几种抗体-细胞因子融合体进行了测试，通常可用于鉴定新型免疫调节产物。新开发的方法还揭示了细胞因子增强的机制，该机制基于抗体介导的肿瘤坏死因子超家族成员在肿瘤相关细胞外基质成分上的聚集。

免疫检查点抑制剂在治疗各种形式的癌症方面的临床成功1，2，3激发了发现和开发新型免疫刺激产品的研究活动。已经考虑将各种类型的工程化细胞因子产品(例如，抗体-细胞因子融合蛋白4，5，6和聚合物-细胞因子缀合物7，8、趋化因子9和Toll样受体激动剂10)用于癌症治疗应用。

新型免疫刺激产品的开发需要实施可靠的定量方法来确定生物活性。这种方法在研究阶段和工业生产期间都很重要，因为在整个开发过程中证明一致的生物活性是质量保证和能够比较实验结果的先决条件。

目前，已为个别产品建立了专门的检测方法，但大多数方法并不容易适用于不同类型的生物制药11。例如，白细胞介素-2 (IL-2)活性通常通过诱导T细胞起源的CTLL-2细胞系增殖的能力来测量12，而白细胞介素-12 (IL-12)活性测试通过NK细胞起源的NK-92细胞测量干扰素-γ的产生。肿瘤坏死因子(TNF)和基于TNF的生物药物的活性通常通过杀死转化的成纤维细胞系15来测量，而TNF超家族的其他成员则根据它们刺激脾细胞产生促炎细胞因子16，17或脾亚群增殖18，19的能力来研究。

为单个产品开发专用方法通常很麻烦，可能需要产生稳定转染的细胞系。此外，技术参数的优化，如细胞生长条件和剂量反应关系，可能是耗时的。我们的实验室致力于开发和表征100多种不同的抗体-细胞因子和抗体-趋化因子融合蛋白4，21，并已学会重视稳健、可靠和广泛适用的细胞因子工程产品研究方法的重要性。

在这里，我们报道了两种通用报告细胞系的发展，它们来源于T和B淋巴细胞，可广泛用于免疫刺激剂生物活性的定量。由于NF-κB信号在许多不同的炎症过程中起着重要作用，我们使用了带有NF-κB活性报告基因的病毒转导方法。

术语NF-κB指在NF-κB蛋白质家族成员之间形成的各种同型和异型二聚体。NF-κB蛋白家族的成员都共享一个相关的REL同源结构域(RHD ),该结构域赋予DNA结合和二聚化。活化的NF-κB二聚体定位于细胞核，在那里它们与具有松散共有序列5′-gg rnn(wy ycc)-3′-的NF-κB反应元件结合(其中R:嘌呤，N:任何碱基，W:腺嘌呤或胸腺嘧啶，Y:嘧啶)23，24，25，从而激活多种靶基因的转录(通过与基础转录因子和辅因子的相互作用)。在没有信号的情况下，NF-κB蛋白以预先形成的复合物的形式存在于细胞中，该复合物可以在有信号时被迅速激活24，25。信号复合物可以通过抑制蛋白的降解或者通过上游信号成分去除抑制蛋白结构域来激活。

尽管I类细胞因子通常通过JAK/STAT激活27发出信号，但有证据表明它们中的大多数也直接或间接）触发NF-κB的激活。相比之下，蛋白质TNF超家族成员通过募集TNF受体相关因子(TRAFs)发出信号，这些因子通过经典和非经典途径激活NF-κB。

新开发的细胞系(称为CTLL-2-NF-κB和A20-NF-κB)用于实施一般的生物测定，该生物测定与用于表征各种类型的工程化细胞因子产物的既定程序进行比较。此外，基于抗体介导的多聚体免疫刺激有效载荷(例如，TNF超家族成员)在肿瘤相关细胞外基质成分上的聚集，新方法允许发现细胞因子增强的新策略。

图1:设计报告细胞系的策略:[a]通过大多数免疫相关受体的信号导致NF-κB23，30，39，40的激活[b]编码分泌型荧光素酶(NanoLuc)和mCherry的报告构建体被NF-κB反应元件(NF-κB-RE)下游的T2A序列分离，用于T和B细胞来源的细胞系的病毒转导(TCR: T细胞受体，TNFR: TNF受体，IL4 R: IL-4受体）

在这项工作中，我们提出了两个报告细胞系的发展，可用于测量各种细胞因子的生物活性。新方法利用了许多细胞因子触发的信号事件在NF-κB激活水平上聚集的事实。

可以发现用传统的基于细胞的细胞因子活性测定法和新开发的方法进行的IL-2的生物活性测量之间有极好的一致性[图2a]。对于具有鼠有效载荷的两种融合蛋白(L19-IL12和F8-TNF)，可以观察到传统的基于细胞的细胞因子测定和新方法之间的差异，对于这两种融合蛋白，新方法表明效力降低[图2b，c]。NF-κB信号传导可能不能完全捕获由鼠IL-12和鼠t NF触发的分子事件，但新方法仍然能够对多种促炎有效载荷和细胞因子变体(例如，野生型和突变型)进行比较评估。

鼠4-1BBL的活性可以通过在特定肿瘤相关的细胞外基质成分上聚集抗体融合物而增强的观察结果是令人惊讶的，并且对于药物应用是潜在有用的。鼠4-1BBL不能形成稳定的同源三聚体，而是形成低活性的同源二聚体结构55，56。可能F8融合体在含EDA的纤连蛋白上的高密度结合促进了超分子组装体的形成，其以浓度依赖的方式获得信号活性[图4b]。这种方法在细胞外基质上模拟了在鼠细胞上发生的情况，其中二聚体配体的多个拷贝的表面展示将无活性的同型二聚体转变为活性多聚体组件55，56。先前已经报道了某些鼠TNF融合蛋白和TNF超家族的其他成员对抗原结合的一些增强作用58，59。原则上，对抗体-细胞因子融合体进行工程改造是有吸引力的，这种融合体在疾病部位获得活性(例如，在抗原结合时)，同时不伤害正常组织，因为这种方法可以产生具有改善的治疗指数的生物药物。我们小组最近描述了一个概念上类似的策略，基于异二聚体分裂细胞因子融合体(如白细胞介素-12超家族成员)的装配60。抗体-细胞因子缀合物条件性增强的其他策略包括细胞因子活性的变构调节61或细胞因子效力的减弱(“衰减”)62。旨在增强基于条件性寡聚化的抗体治疗活性的策略包括开发六聚IgG抗体以增强补体介导的细胞毒性。

并非所有TNF超家族成员似乎都需要抗原依赖性聚集以获得活性[图2c和4c]。这也反映在TNF超家族的一些配体，包括TNF和CD154，在体内被酶促脱落，并作为可溶性配体65，66。虽然GITRL目前还不知道以可溶性配体和67的形式存在，但我们的数据表明重组可溶性配体表现出类似的行为[图4c]。

在这篇文章中，我们主要集中在重组和工程细胞因子产品。虽然许多白细胞介素主要通过JAK/STAT激活27发出信号，但也诱导了NF-κB驱动的转录事件，这与以前关于这一问题的报道一致28，29，30，31。NF-κB报告基因应该广泛适用于其他种类的促炎产物。Toll样受体和白细胞介素-1受体超家族成员都通过募集MyD88作为其信号转导的一部分来激活NF-κB 39。此外，也有证据表明NF-κB可以被趋化因子信号激活。

CTLL-2和A20细胞系在其表面表达多种具有免疫重要性的受体，因此应该适用于许多不同的生物活性测定。如果研究人员对使用不同的细胞系感兴趣，图1中描述的病毒转导系统应该能够快速制备相应的报道系统。发现mCherry的细胞内表达有助于通过流式细胞仪分选阳性转导的细胞，而分泌的荧光素酶快速简便地读出报道活性。

总之，我们已经产生了新的通用报告系统，用于各种类型的促炎介质和工程细胞因子产物的生物活性的简易测量。我们预计新开发的细胞系和载体可能在生物学、药学和免疫学研究中找到广泛的应用。

Mock, J., Pellegrino, C. & Neri, D. A universal reporter cell line for bioactivity evaluation of engineered cytokine products. Sci Rep 10, 3234 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-60182-4