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系统性的包涵体复性实验显示时间和耳机TSA是决定复性的重要变量

包涵体来源的蛋白质的重折叠是非常有前途的，因为它可以提供高纯度目标蛋白质的可靠来源。然而，基于包涵体的蛋白质生产经常受到缺乏检测正确重折叠蛋白质的技术的限制。因此，重折叠条件的选择大部分是使用试错法实现的，因此是一个耗时的过程。在这项研究中，我们使用了差示扫描荧光导向重折叠方法的最新进展作为分析方法来检测正确重折叠的蛋白质。我们描述了一个系统的缓冲液筛选，它包含一个96孔初级pH重折叠筛选和一个次级添加剂筛选。我们的研究表明，这种方法可以应用于确定几个蛋白质的折叠条件。此外，它揭示了哪些“辅助”分子，如精氨酸和添加剂是必不可少的。四种不同的蛋白质:HA-RBD、MDM2、IL-17A和PD-L1用于验证我们的复性方法。我们的系统方案以高通量的方式评估了“辅助”分子、pH、缓冲系统和时间对蛋白质重折叠过程的影响。最后，我们证明了重折叠时间和二次热转换分析缓冲液筛选是提高重折叠效率的关键因素。

包涵体由未折叠、部分折叠和错误折叠的蛋白质聚集而成。它们通常是由于缺乏伴侣蛋白，在细胞质的还原环境中不能达到正确的构象，并可能经历蛋白水解降解而形成的9。虽然在包涵体中发现的蛋白质由于缺乏生物活性而不能直接用于研究，但它们提供了高纯度的目标蛋白质的高度富集来源。因此，已经广泛报道了几种重折叠方法(例如稀释、透析、层析和微流控芯片10，11，12，13，14)。然而，由于许多蛋白质只能在非常特定的条件下重折叠，因此开发能够平行筛选多个重折叠条件的系统筛选方法仍然具有挑战性。

设计用于确定最佳重折叠条件的几种部分因子重折叠试剂盒(QuickFold [AthenaES]、FoldIt [Hampton research]、iFOLD [Novagen]和QuickFoldTM蛋白质重折叠试剂盒[Molecular Dimensions Limited])可从市场上买到。尽管如此，重折叠的努力仍然受到缺乏平行监测多重重折叠实验的分析测定的限制。更常见的是，重折叠过程是通过替代测定来检测的，例如浊度或吸光度，它们不容易区分正确折叠和错误折叠的蛋白质。同样，SDS-PAGE、体积排阻色谱(SEC)和反相HPLC分析可以解决这一问题，但耗时且与高通量方法不兼容15。最近，Biter等人证明了差分扫描荧光测定法(DSF)指导的蛋白质重折叠(DGR)可以区分重折叠蛋白质的折叠、错误折叠和未折叠状态16。然而，所描述的pH、阴离子、阳离子结晶试验(PACT)筛选被优化用于筛选蛋白质结晶条件，而不是蛋白质重折叠。基于PACT筛选DGR的分析在稀疏基质的基础上评估pH、阴离子和阳离子的影响，并且不涉及广泛使用的重折叠剂，例如离液剂(尿素)或聚集抑制剂(精氨酸)。

在这项研究中，我们开发了一个系统的缓冲液筛选，其中包含一个专用的96孔初级pH重折叠筛选，结合二级添加剂筛选来评估其他重折叠剂(例如离液剂、稳定剂、抗衡离子和还原剂)，作为DGR方法的扩展。我们的研究表明，DGR可以用于确定含有更具体和复杂的缓冲液组成的蛋白质的重折叠条件。为了建立和验证重折叠筛选，使用了四种不同的蛋白质:血凝素的受体结合结构域(HA-RBD)、白细胞介素-17A (IL-17A)、小鼠双微体2同源物(MDM2)和程序性死亡受体1的抑制性受体配体(PD-L1)。我们描述了一个专门的系统方案的开发，该方案能够评估pH、缓冲系统、时间、氧化还原对以及一系列添加剂对蛋白质重折叠过程的影响。我们还表明，在重折叠材料上进行的二次热位移分析(TSA)筛选为去除重折叠剂提供了改善的透析条件。

Wang, Y., van Oosterwijk, N., Ali, A.M. et al. A Systematic Protein Refolding Screen Method using the DGR Approach Reveals that Time and Secondary TSA are Essential Variables. Sci Rep 7, 9355 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-09687-z