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CRISPR/Cas9治疗HIV的研究进展

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，其以消灭外来的质体或者噬菌体并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。CRISPR/Cas系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。

 基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。如今科学家们在细菌中已经发现三类CRISPR/Cas系统，其中以II型系统应用较多，即一个Cas9核酸酶利用sgRNA就可以完成识别和切割靶双链DNA，因此II型系统也被称作CRISPR/Cas9系统。Cas9含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双链中的一条链；对这两种RNA进行人工设计，可以改造形成具有引导作用的sgRNA，足以引导 Cas9 对双链DNA 的定点切割。

 以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，比如艾滋病、血液病、肿瘤和其它遗传性疾病。本文中小编就盘点了CRISPR/Cas9治疗HIV感染的一些突破性进展。

【1】Nat Commun：大刀砍向HIV病毒--CRISPR系统初步成功应用

doi：10.1038/ncomms7413

 想象一下，一个成分单一的药物，可以防止人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，也能治疗已经感染艾滋病毒的患者，甚至能清除比HIV更厉害的病毒的所有休眠副本。这听起来像科幻小说，但已经有科学家们开始一步步接近于这个目标。他们通过定义和利用细菌和基因剪刀手CRISPR/Cas9系统，为细胞创造了一个新的防御系统。这篇研究成果，发表在最新的Nature Communications。

 当HIV病毒复制潜入人体细胞，它们就会导致混乱。它使用细胞本身的分子机制制成病毒遗传物质的副本，这些副本随后埋葬细胞自身的基因。从此之后，主体细胞变成一个HIV工厂，使得病毒大量复制，以遍布全身。现有的HIV药物主要瞄准这一生命周期中的各个步骤：比如说一些阻止病毒整合进入细胞的DNA，而另一些尝试包括停止受HIV影响的细胞生产更多的病毒。不过这些药物的问题在于它们不能真正删除那些隐藏在细胞的病毒DNA。这些病毒可以保持休眠状态数年之久，然后再次激活。所以病人通常需要每天或每周的使用药物来保障他们的生活，因为HIV可以潜伏。不过这样花费的金钱，时间和精力实在难以估量。

【2】艾滋病治疗重大突破！科学家成功从人类免疫细胞上移除HIV-1病毒

 人类后天免疫不全病毒（HIV）是医学界的恶梦，自病情扩大几十年以来，都还找不出能完全治愈病患的方式，只得以鸡尾酒疗法或服用抗反转录病毒药物（antiretroviral therapy）减缓病情发作，并藉此延长病患寿命。日前，一研究团队用基因编辑技术成功的将 HIV-1 的去氧核糖核酸（DNA）从人类的免疫细胞上移除，并防止病毒进行进一步的复制与再感染。

 来自美国天普大学（Temple University）的研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将人体免疫反应中扮演重要角色的T细胞上的HIV-1病毒移除，让它没有办法再进一步的感染其他健康细胞。而所谓的CRISPR/Cas9技术，就是科学家利用向导RNA（guide RNA）更动细胞DNA中被瞄准的部位。

 早前，此团队就已成功将HIV-1的DNA从人体免疫细胞上移除，最近一期的研究更显示，清除过后的细胞，就不会再被HIV病毒感染。研究团队成员之一的Kamel Khalili博士表示，抗反转录病毒药物可帮助病患控制HIV的感染病情，但只要病患忘记或者是停止服用此药物，病毒就会自行开始复制，导致病情再度恶化。

【3】Nature子刊：首次利用CRISPR/Cas9在体内成功切除HIV DNA片段

doi：10.1038/gt.2016.41

作为一种RNA病毒，HIV是一种逆转录病毒。当感染人细胞（主要是CD4+ T细胞）时，它会将自身的RNA逆转录为DNA后插入到宿主基因组中以便进行复制和合成新的病毒颗粒。

 在一项新的研究中，来自美国天普大学刘易斯-卡茨医学院的研究人员利用基因编辑技术首次成功地从活的动物基因组中切除HIV-1 DNA中的一段序列。这一突破是开发一种潜在地抵抗HIV感染的治疗策略的关键一步。相关研究结果发表在2016年5月19日那期Gene Therapy期刊上，论文标题为“Excision of HIV-1 DNA by gene editing： a proof-of-concept in vivo study”。 论文通信作者、天普大学刘易斯-卡茨医学院神经病毒学中心主任Kamel Khalili博士解释道，“在这项概念验证的研究中，我们证实我们的基因编辑技术能够高效地应用于两种小型模式动物的很多器官中，而且能够将HIV病毒DNA的较大片段从宿主细胞基因组中切除。”

【4】Nature子刊：利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1

doi：10.1038/srep22555

人免疫缺陷病毒（HIV）导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS），即艾滋病。在一项新的研究中，来自美国天普大学路易斯-卡茨医学院（Lewis Katz School of Medicine at Temple University）的研究人员开发出一种特定的基因编辑系统CRISPR/Cas9，从而为最终治愈HIV感染铺平道路。他们证实利用这种基因编辑系统能够有效地和安全地将这种病毒从在体外培养的人T细胞的DNA中清理掉。相关研究结果于2016年3月4日在线发表在自然出版集团旗下的Scientific Reports期刊上，论文标题为“Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing”。

论文共同通信作者、天普大学路易斯-卡茨医学院综合NeuroAIDS中心主任、神经病毒学中心主任、神经科学系主任和教授Kamel Khalili博士说，“抗逆转录病毒药物非常善于控制HIV感染。但是接受抗逆转病毒药物治疗的病人一旦停止服用药物，就会遭遇到HIV复制快速反弹。”大量HIV拷贝的存在削弱免疫系统，最终导致AIDS。

治愈HIV/AIDS---自从上个世纪八十年代首次发现HIV以来，它已夺去了2500万多人的生命---是HIV研究的最终目标。但是一旦它整合进CD4+ T细胞---HIV感染的主要细胞---的基因组后，清除这种病毒已被证明非常困难。近期的努力有意专注于重新激活HIV以便触发强劲的免疫反应从而能够从被感染的细胞中根除这种病毒。然而，在此之前，这些“激活并杀死（shock and kill）”方法中没有一种获得成功。

【5】CRISPR/Cas9--基因编辑的魔法剪刀手

 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等。目前，基因组编辑有三大技术：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。与传统的TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9系统更便捷、高效，应用也更广泛，目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。

CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR-associated），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。

【6】Cell子刊：HIV会对CRISPR/Cas9基因编辑技术产生耐受性

doi：10.1016/j.celrep.2016.03.042

 一项刊登于国际杂志Cell Reports上的研究论文中，来自犹太综合医院等机构的研究人员通过研究发现，CRISPR/Cas9基因编辑平台在用作有效的抗病毒疗法之前或许还需要进行一些微调，通过利用CRISPR/Cas9在细胞DNA中突变HIV-1，研究人员发现，当单一突变可以抑制病毒复制时，其中有些突变还会促进病毒产生耐药性，靶向作用多个病毒DNA区域对于开发有效的CRISPR/Cas9抗病毒疗法显得非常必要。

 当进入细胞后HIV的RNA基因组就会转换形成DNA，并且缠绕到细胞的DNA上，CRISPR/Cas9技术可以被重编程来靶向作用DNA序列并且清除病毒自身的DNA，但当前的问题是HIV非常善于生存下去，即便产生了新的突变病毒依然生机勃勃，因此当通过靶向疗法杀灭许多病毒时，总会有一些病毒逃脱CRISPR/Cas9的杀灭作用。

 【7】艾滋病毒新疗法：有望在三年内实现临床试验

近日，美国科学家已经借助革命性的基因编辑技术实现了艾滋病治疗研究的巨大进步。来自宾夕法尼亚州天普大学（Temple University in Pennsylvania）的这个研究团队经过数年的研究，已经借助他们创造的新技术从人类细胞中“剪掉”了艾滋病毒。

这项成功的实验是在实验室中进行的，但是研究团队确信这种治疗方法在三年内就能够在人类身上进行临床试验。在2014年的一项研究中，研究人员就成功的从正常人类细胞中移除了艾滋病毒的DNA。这一次，他们借助同样的技术从感染病毒的T细胞中移除了艾滋病毒。

T细胞在人体免疫系统中有着重要的角色，这次研究让研究人员更精准的模拟了如何治疗患者体内的艾滋病毒。在研究中，研究人员从感染艾滋病毒的患者处抽取了血液。研究人员将感染者的T细胞在实验室中进行了培养，随后通过Crispr/Cas9基因编辑系统进行了治疗，这一过程中一种靶蛋白会借助生物酶从细胞中移除艾滋病毒的基因序列。

【8】JARG：重磅！我国科学家基因编辑人类胚胎抵御HIV！争议或将再度升温！

doi：10.1007/s10815-016-0710-8

 近日，刊登于国际杂志the Journal of Assisted Reproduction and Genetics上的一项研究论文中，来自广州医科大学的研究人员阐述了他们的最新研究成果，文章中研究人员利用基因编辑技术CRISPR/Cas9对人类胚胎进行了遗传性修饰，研究者表示，他们所研究的人类胚胎携带着额外一组染色体，而且胚胎均为死亡胚胎组织。

 当然对人类胚胎进行任何遗传性的改造修饰都是具有争议的，很多医学研究者认为总有一天这样的尝试将会变得非常普遍，但如今我们仍然不知道对人类胚胎进行遗传性修饰到底会带来什么样的后果，而基于伦理学等很多限制，全球很多研究机构都推迟了这一研究。仅在一年前来自中山大学生命科学学院的“80后副教授”黄军就在《Protein & Cell》杂志上首次发表了编辑人类胚胎相关的研究论文，此后由此引发了一系列的伦理学争论。

 【9】Science：基因治疗或成为对抗HIV的新武器

 在芝加哥举行的抗微生物制剂与化学疗法跨学科会议上，研究者报道了2项小型研究的初步结论，他们通过破坏T细胞表面的CCR5受体来达到抗HIV的目的，CCR5受体是HIV感染T细胞的主要受体。他们希望能借此使患者脱离抗逆转录病毒药物。

 研究人员将患者血清中的T细胞分离出，然后通过酶工程学方法对其进行修饰。他们使用锌指核酸酶找出编码CCR5的基因，并将其破坏，最后再将这些修饰后的T细胞回输至患者体内。通过试验，研究者发现经处理后的T细胞约有25%的CCR5受体发生了突变。在部分患者中，经修饰后的T细胞的生存时间超过了6个月。

 研究者称，他们并不指望该方法能将HIV从体内完全清除，但是他们希望能通过这种治疗，使患者达到“功能治愈”，也就是说，让患者摆脱抗逆转录病毒药物。

 美国北加州大学的病毒学家大卫·马戈利斯称，这种基因治疗仍面临许多问题，他说：“这些数据非常吸引人，也非常鼓舞人心，但仍不够完整。”经人工修饰CCR5基因后发生突变的T细胞比例给马戈利斯留下来非常深刻的印象。

【10】美国“基因编辑技术”有望成功治愈艾滋病

 近日，美国加利福尼亚大学研究人员的最新研究报告显示，通过基因编辑技术改变艾滋病患者的DNA序列，就可以让该患者有效抵抗艾滋病毒的侵害。目前，该研究成果在理论上已被证明切实可行，但实际操作是否同样可行，这还需通过长期的实验来进一步确认。

 艾滋病患者蒂莫西·雷·布朗(Timothy Ray Brown)在经过骨髓移植后被成功治愈，但毕竟骨髓的捐赠者少之又少。然而，正常人体内都有艾滋病毒的天然抗体，这其中又有一部分人携有两个一模一样的CCR5(细胞内--趋化因子的受体)变异基因，而CCR5变异基因则是有效的艾滋病治愈武器。所以，加利福尼亚大学的研究员表示，只要通过基因编辑技术改变艾滋病患者体内的DNA序列，导入一个CCR5变异基因，就能让该患者产生艾滋病毒抗体。然而，只有1%的欧洲人携有CCR5变异基因，这类人群在全球也同样有限 。