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CRISPR SAM：激活内源基因表达的便利工具

Konermann 发表的CRISPR SAM通过dCas9-VP64融合蛋白、改造过的sgRNA、RNA结合激活蛋白三个原件，实现了对多数细胞内源基因的特异性激活。该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。

研究基因功能时，一般采用RNAi基因敲减、Cas9基因敲除做出基因功能缺失的表型，额外转入基因表达质粒，产生基因激活表型。通过比较缺失表型和过表达表型的生物功能特性分析基因功能。

对于比较大的基因以及难以克隆的基因，比如部分受体和通道蛋白编码序列可以达到10kb以上。构建基因表达质粒会很困难，因此很难做出过表达的功能表型。

CRISPR SAM可以通过导入几个简单的原件，即可实现对任何一个基因的特异性激活，从而避开了基因克隆和构建复杂表达载体的难题。更惊喜的是，在细胞中稳定表达dCas9-VP64、RNA结合激活蛋白后，只要简单导入极小的特异性sgRNA，就能得到特异性激活指定基因的细胞，为基因功能研究开辟了广阔的前景。

CRISPR SAM（synergistic  activation mediator）采用切割活性缺失的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白，加上能与RNA结合蛋白MS2的sgRNA2.0，特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用，能更好的模拟细胞内转录激活（图1，CRISPR/Cas9 SAM原理）。据文章中数据显示，单一位点SAM的转录激活效果远高于多个位点dCas9-VP64的转录激活效果。

图1、CRISPR/Cas9 sam原理图（来自Konermann，et al. Nature, 2015）

CRISPR/Cas9 sam使用时需要先构建dCas9-VP64及MS2-P65-HSF1稳定表达细胞株。这一步通常采用慢病毒包装感染和抗生素筛选稳定细胞来完成。筛选完成后，特异性sgRNA可以通过质粒直接转染、sgRNA转染、病毒转染等多种方法，实现指定基因的激活（图1，CRISPR/Cas9 SAM工作流程）。

图1、CRISPR/Cas9 sam流程图（来自Konermann，et al. Nature, 2015）

CRISPR/Cas9 sam的更大优势在于要同时激活相关联的数个基因，只需要同时导入特异性的多个sgRNA即可实现。这对研究需要多个基因协同发挥做用的信号通路研究、转录功能研究，以及由多个亚基构成的大蛋白功能研究尤其有用。