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几种常见CRISPR/Cas9基因编辑实验方案——简便VS高效

RISPR/Cas9技术极大方便了基因编辑的操作。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑,其基本原理为:第一步先对需要编辑的位点进行切割,造成DNA断裂;第二步用细胞的DNA修复机制对DNA断裂点进行修复。从而产生需要的突变结果。

 

目前主要有两种方式进行基因敲除:通过邻端接合反应敲除目的基因或者通过同源重组敲除目的基因。邻端接合反应的优势在于只需要对DNA切割后,细胞自身就能修复。由于不需要重组载体,只需要转入Cas9蛋白和sgRNA就能开始实验,启动非常快速。同源重组法需要在导入Cas9蛋白和sgRNA的同时,转入同源重组的修复。

 

 

邻端连接法基因编辑

重组法基因敲除、敲入

定点突变

重组模板

不需要

需要

需要

重组模板类型

-

质粒、PCR产物、单链DNA

PCR产物、单链DNA

正确克隆率

修复方式

邻端连接随机修复

精确重组修复

精确重组修复

抗性基因表达方式

瞬时表达

稳定表达

瞬时表达

抗性基因残留

1、几种基因编辑方法比较

 

邻端接合基因敲除

优点:

1、 只需构建一个载体就能开始实验,启动快速。

2、 实验设计简单。

缺点:

1、 突变随机。后期鉴定工作量大。

2、 基因功能缺失对细胞生长有影响时,很难获得敲除成功的细胞。

 

原理:

 

工作流程:

 

重组法基因敲除

优点:

1、 抗性基因稳定整合到基因组中,阳性率很高。

2、 筛选较为容易。

缺点:

1、 实验设计较复杂。

2、 需要同时构建基因敲除载体和重组修复载体,实验启动慢。

 

重组法基因敲除原理

 

重组法基因敲除流程

 

重组法定点突变

定点突变是对指定位置的一个或者数个碱基进行精确编辑。定点突变的目的不是基因功能缺失,而是基因功能的改变。

与重组法基因敲除相比,定点突变要求编辑后基因组上不能残留抗性基因。因此有一定可能未能正确突变的细胞在筛选中存活。定点突变基因编辑的难度要大于基因敲除。

在我们的pCas9gRNA7基因编辑载体中含有lig4KU70抑制RNA,可以显著抑制非重组DNA修复途径,极大的提高定点突变成功率。

 

定点突变原理:

定点突变实验流程:

 

pCas9gRNA7系列Cas9gRNA表达载体:适合各种基因编辑方法。

我们经过反复实验和验证,开发的pCas9gRNA7系列载体有多种型号,适合各种基因敲除和编辑的实验方案。

货号

品名

适用

CR5002SH

pCas9gRNA7载体构建试剂盒(单靶点)

重组法基因敲除/敲入

CR5002DH

pCas9gRNA7载体构建试剂盒(双靶点)

重组法基因敲除/敲入

CR5002GSH

pCas9gRNA7-GFP载体构建试剂盒(单靶点)

重组法基因敲除/敲入

CR5002GDH

pCas9gRNA7-GFP载体构建试剂盒(双靶点)

重组法基因敲除/敲入

CR5002PSH/ BSH

pCas9gRNA7-Puro/Bsd载体构建试剂盒(单靶点)

重组法定点突变

CR5002PDH/ BDH

pCas9gRNA7-Puro/Bsd载体构建试剂盒(双靶点)

重组法定点突变

CR5002PS/BS

pCas9gRNA7-Puro/Bsd载体构建试剂盒(单靶点)

邻端连接法基因敲除

CR5002PD/BD

pCas9gRNA7-Puro/Bsd载体构建试剂盒(双靶点)

邻端连接法基因敲除

 

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