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筛选稳定表达Cas9蛋白的细胞株

    一、试剂

     

    1. 细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。
    2. 转染辅助试剂Polybrene(用水配制为6mg/ml,-20℃冻存)。
    3. Cas9表达慢病毒(制备方法见Cas9慢病毒包装实验)。
    4. 嘌呤霉素或者G418。

     

    二、实验步骤

    1、 转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。
    2、 取出制备好的Cas9表达慢病毒(pLV-Cas9-Puro包装得到,制备方法见Cas9慢病毒包装实验),室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液:
    以感染1个12孔板细胞(细胞培养基体积1ml)为例
     病毒液 50ul
     细胞完全培养基到950ul
     加入Polybrene到终浓度为6ug/ml
    3、 用病毒感染液替换原细胞培养基,继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。
    4、 病毒感染48小时后,转入的基因开始表达。这时可以加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml。
    5、 在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养,每隔2-3天应该换液一次,去除死细胞,补加抗生素。
    6、 大约6-7天,细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞,进行检测。

     

    三、PCR检测细胞基因组中的Cas9基因

    用基因组PCR检测293T-Cas9细胞中的Cas9基因。

     

    鉴定引物:
    Cas9-F:ACAGTCTTCACGAGCACATC
    Cas9-R:TCCTCTTCATCCTTTCCCTA
    产物大小198bp


    步骤:

    1、 分别提取293T-Cas9细胞和293T细胞的基因组DNA。
    2、 PCR扩增
    反应体系:
    2×Taq Mix 25ul
    Cas9-F(10uM)2ul
    Cas9-R(10uM)2ul
    基因组模板 5ul
    加水补足50ul

    反应条件:95℃ 预变性5min;95℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃ 30sec,35个循环。
    3、 电泳检测PCR产物

    M:DL2000 DNA marker
    1:293T-Cas9扩增产物
    2:293T扩增产物

     

    四、 相关实验

  • Cas9表达慢病毒包装
  • 用pTYNE载体验证Cas9过表达细胞系

 

五、 相关产品

 


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