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siRNA的合成方法

标签: 发布时间:2013-07-09

siRNA合成的方法主要包括:

1、化学合成

2、体外转录

3、长片断dsRNARNaseIII类降解(如DicerE.coliRNaseIII

4siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs

5PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达

前三种方法主要都是体外制备siRNAs,并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。后两种方法的优点在于不需要直接操作RNA,依赖能够表达siRNAsDNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有有缺点,具体那种方法最好取决于试验目的。

一、化学合成siRNA分子:

尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的。研究人员几乎不需要做什么工作。生物公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格相对来说比其他方法高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3-4siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究

不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

二、体外转录合成siRNA分子:

通过体外转录的方法可以合成siRNAs,这样的成本相对化学合成法而言比较低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。毕竟,化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。

优点:体外转录得到的siRNA毒性小,稳定性好,效率高。达到同样的转染效率只需要化学合成量的1/10

最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA,长期研究。

三、用RNase III 消化长片断dsRNA制备siRNA

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。优点:①有很高的有效性。②可跳过检测和筛选有效siRNA序列步骤,节省时间和金钱。

缺点:可引发非特异的基因沉默,特别是同源或密切相关的基因。

最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗

四、siRNA表达载体:

多数的siRNA表达载体依赖3RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(36个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几天的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增,这个优点足以弥补所有缺陷,特别是当载体在实验中确实有效的时候。如果您选择shRNA,有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的。此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板, 正义与反义序列之间由一段环(loop) 序列隔开, 插入载体Pol Ⅲ启动子下游, 然后转入细胞,环序列可使转录出的RNA 链折叠成具发夹结构的小RNA 分子, 这些小RNA 可被细胞内的Dicer 切割为长21bp siRNA 19 对互补碱基, 3'端各有2 U 突出, 可引起特定基因沉默。与化学合成及体外酶法合成相比, 表达载体是在细胞内通过转录持续产生siRNA , 所以可延长siRNA 作用时间, 目前此法已被广泛应用。

优点:可进行较长期研究,带有抗生素标记的载体可在细胞中持续抑制靶基因的表达。

最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。

不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)

五、siRNA表达框架:

siRNA表达框架(siRNA expression cassettesSECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事采用,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配!如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话,那问题就可以解决了。另外,没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。

优点:无需载体克隆测序,是最有效的筛选siRNA工具,甚至可用以筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA最适搭配。

缺点:PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话,那可以解决很大问题。另外,不能进行序列测定,PCRDNA合成时可能差生的误读不能被发现,可能会因此导致结果不理想

缺点:①PCR产物很难转染到细胞中,②不能进行序列测定,PCRDNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想。

最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子。

不适用于:长期抑制研究。

 


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