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慢病毒包装体系

    英茂盛业包装体系经过特别优化，包装效率超过目前现有的大多数包装体系。配合本公司的慢病毒RNA干扰或过表达载体及转染试剂，通常可以产生大约10^7 TU/ml的未浓缩病毒上清液，无需纯化即可用于大多数细胞的感染实验。

产品规格

载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。

慢病毒载体

慢病毒载体

中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达，从而产生基因RNA干扰或基因过表达效果。
pLV-EGFP-C的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网页慢病毒载体构建。

辅助载体

慢病毒辅助载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。本公司辅助载体经过优化，包装效果极为稳定，与现有的全部慢病毒载体兼容。配合本公司的慢病毒载体可产生高滴度病毒上清。图谱见下：

Polyfect-C转染试剂

是我公司专为293T细胞转染及慢病毒包装研发的转染试剂,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。

293V细胞

包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。293V细胞专为病毒包装构建，细胞性状稳定，转染效率高，贴壁牢固。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。

慢病毒包装

概述：

病毒包装前需制备转染级慢病毒载体及两种包装载体。为保证转染效率，请采用 Qiagen 转染级试剂盒或类似质量级别试剂盒制备质粒。

以下采用我公司的 Polyfect-C 转染试剂（货号 P2011）为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。无论采用哪种转染试剂，3 种载体的相对比例应保持不变。

本例中病毒包装采用 10cm 培养皿。如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。

试剂

293V 培养基：DMEM 高糖培养基+10%FBS

病毒培养基：DMEM 高糖培养基+10%FBS，丙酮酸钠 1mM。

Polyfect-C 转染试剂

转染级慢病毒载体，包装载体 pH1 及 pH2。

实验步骤

1、 转染前 24 小时，将 293V 细胞以 4-5×10 6 /10cm 平皿密度接种，加入 10ml 培养基 37℃，5% CO₂培养。细胞转染前密度应达到 90%。

2、 吹吸混匀 Polyfect-C 转染试剂。

3、 准备 2 个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

8、 充分混匀。

9、 将转染试剂稀释液（离心管 2）加入质粒 DNA 溶液（离心管 1）中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。

10、 室温孵育转染混合液 5 分钟。混合液可以在 2 小时内保持稳定。

11、 将转染混合液逐滴加入步骤 1 准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。

12、 37℃培养。

13、 6 小时后，用 10ml 病毒培养基换液。

14、 转染后 48-72 小时收集细胞培养上清。500g 离心 10min 去除细胞碎片。该上清可以直接用于慢病毒感染，也可以进行病毒浓缩纯化。如需长时间保存，可-80℃冻存。注意每次冻融将导致病毒滴度下降 2-4 倍。培养时间超过 72 小时病毒滴度会显著下降。

慢病毒滴度测定

在需要用确定的感染复数获得稳定的感染效果时，需要对病毒滴度进行测定。病毒滴度测定最好直接用收获和纯化的病毒液进行，也可以用冻存的病毒液。值得注意的是采用不同的细胞系和方法测定的病毒滴度会存在很大差异。测得的病毒滴度值和感染靶细胞所需的病毒滴度相差可能很大。但是每次采用相同的方法测定病毒滴度还是可以对病毒包装效果进行一个较为准确的衡量标准。

病毒滴度测定可以采用 Realtime-PCR、抗生素筛选细胞克隆法以及流式细胞对荧光细胞进行直接计数等。也可以采用商业的病毒滴度测定试剂盒。具体实验方法可以参考(R. H. Kutner, 2009)中的方法进行。

慢病毒感染靶细胞

以下方法可用于感染一般贴壁细胞如 293V 细胞，CHO 细胞等。在病毒感染时添加 polybrene 可以增加病毒感染效率。但是polybrene可能对某些细胞系产生毒性。在使用前可以通过预实验确定合适的polybrene浓度，一般为 4-12μg/ml。

1、 感染病毒前 18-24 小时将细胞以合适的密度接种到培养皿。

2、 室温溶解病毒液，混匀。

3、 将适量病毒液和 polybrene 用细胞培养基稀释，加入细胞培养皿中。

4、 继续培养 24 小时，用新的完全培养基替换病毒感染液。如果病毒液或 polybrene 对细胞生长有较大影响可以将病毒感染时间缩短至 6-8 小时。

5、 病毒感染后 48-72 小时可以观测到外源基因表达。这时细胞可用于荧光检测或加入抗生素筛选稳定细胞株。

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（如不能下载，请右键点击下载链接，选择另存为。或联系本公司客服人员QQ1291769782,3565704723）

相关服务

RNA干扰服务 基因合成服务 基因克隆服务 慢病毒包装服务 稳定细胞株筛选服务 蛋白表达服务 Polyfect-C转染试剂