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重庆英茂盛业Cas9体外酶切试剂盒——快速可靠的验证sgRNA靶点

重庆英茂盛业Cas9体外酶切试剂盒— —快速可靠的验证sgRNA靶点

CRIPSR/Cas9系统以其高效、易操作、便捷的特性，极大地方便了基因编辑实验，为生物的基因敲除、敲入、突变提供了有力的新工具。Cas9的靶点由19个nt+NGG构成，不同的Cas9靶点有不同的切割效率。在设计时，通过生物信息学可以对Cas9靶点的非特异性切割（脱靶）进行一定预测，但是对于切割效率目前还没有比较好的方法在设计时进行预测。 

CRISPR/Cas9基因编辑中后续的细胞或者动物筛选实验时间长、耗费大量精力和资金。因此，在转染靶细胞和筛选前多设计几个靶点并且逐一验证切割效率，可以显著节省整体实验时间、减少工作量及提高基因编辑成功率。 

重庆英茂盛业新研发的Cas9体外酶切试剂盒完成体外酶切实验仅需30分钟，为您快速筛选有效靶点提供了便利的工具。

1.pTYNE（货号：CR1011）细胞转染验证Cas9靶点切割效率

我们最初设计pTYNE载体是用于体内实验检测TALEN基因编辑系统的切割效率。其原理为pTYNE载体上有突变的EGFP基因。使用时将切割靶点插入载体中，再将构建好的pTYNE载体和切割靶点的载体（在Cas9系统为Cas9蛋白和sgRNA表达载体）同时转入细胞，如果成功切割靶点造成DNA断裂，则EGFP基因在细胞的NHEJ作用下得到修复，从而产生正确的EGFP蛋白，细胞出现荧光。

图1、pTYNE载体验证验证A、B、C个靶点。实验组为连接了靶点序列的pTYNE载体和对应的sgRNA、Cas9表达载体共转染293V细胞。阴性对照为同一个pTYNE载体与无关sgRNA、Cas9表达载体共转染293V细胞。阳性对照为同一个pTYNE载体与已验证能高效切割pTYNE载体的sgRNA、Cas9载体共转染293V细胞。
详细实验步骤请见：http://inovogen.com/news/2014/1111/330.html。

pTYNE载体的体内实验可以有效验证靶点。但是需要每个靶点需要构建一个pTYNE验证载体和一个sgRNA表达载体。整体验证实验实验包括载体构建至少需要2周，实验周期长，比较费时费力。
因此，我们设计了体外验证靶点的Cas9体外酶切试剂盒。

Cas9体外酶切试剂盒验证靶点

Cas9体外酶切验证靶点采用体外转录sgRNA、体外切割靶序列、琼脂糖凝胶电泳检测切割效率。完全避免了耗时的载体连接、鉴定及测序等费时的工作。sgRNA转录试剂盒提供了sgRNA转录模板制备到转录所需的试剂，Cas9体外酶切试剂盒中包含体外酶切所需的酶、反应缓冲液及阳性对照实验试剂。客户进行设计靶点，合成1条PCR引物就能完成整个实验。从sgRNA转录到完成体外酶切的全部实验可在2天内完成。
实验流程：

图2、Cas9体外酶切实验流程

图3、PCR扩增pUC57载体上约700bp片段，设计3个靶点。分别转录为sgRNA。通过Cas9体外酶切试剂盒对3个靶点的切割效率进行验证。图A：扩增的sgRNA转录模板。图B：转录的3个sgRNA。图C：PCR扩增的700bp切割底物。图D：Cas9体外酶切产物电泳结果。阴性对照采用不加sgRNA。可以看出靶点3效果最好、靶点1次之、靶点2最差。
详细实验步骤见：http://www.inovogen.com/news/2016/0708/437.html

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