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细胞周期的测定

标签:发布时间:2013-03-18 02:45:17

一、原理
细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。
测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。
BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,稳定细胞系构建就可算出细胞周期的值。

 

二、仪器、用品与试剂
1、仪器、用品:同常规细胞培养
2、试剂:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液

 

三、操作步骤
1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml。
2、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
4、常规染色体制片(见第三部分:染色体技术)。
5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。
6、弃去2×SSC液,流水冲洗。
7、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。
8、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
9、计算:
细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)
附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。
(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,柠檬酸三钠•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。


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