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CRISPRCas9基因敲除大肠杆菌BL21菌种中的lacZ基因

CRISPR/Cas9基因编辑技术可以在各种生物中实现基因组编辑。英茂盛业采用新研发的大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒（CR3011），实现了敲除BL21菌种中的lacZ（β-半乳糖苷酶）基因，敲除效率高达90%。




实验原理

β-半乳糖苷酶基因是大肠杆菌乳糖代谢途径中的一个酶。β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β--D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。这个反应被广泛用于基因工程中蓝白斑筛选鉴定重组质粒。通过CRISPR/Cas9编辑β--半乳糖苷酶基因，造成β-半乳糖苷酶基因功能缺失，编辑后的BL21菌种将不能代谢X-gal产生蓝斑。

 

实验材料

大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒（英茂盛业，CR3011）




• Clone  Direct PCR Mix（英茂盛业，P3001）

 

靶点和实验方案设计

根据BL21中β-半乳糖苷酶基因序列，设计基因敲除靶点和重组修复模板。




设计方案：






基因编辑后序列：






设计的引物列表：

引物名称	序列5’-3’	用途
LacZ-target	TCCTAGGTATAATACTAGTcgttttacaacgtcgtgactGTTTTAGAGCTAGAAATAGC	合成sgRNA表达框。
lacZ-JD-F	TTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT	PCR鉴定基因编辑克隆，阴性145bp，阳性119bp。
lacZ-JD-F	AGGGGGATGTGCTGCAAGGCGA
LacZ-HR-F	TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCAAAACC	合成重组模板
LacZ-HR-R	GGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTGCCAGTGAATCCG

 

实验步骤

一、制备表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞

1、pFN-Cas9载体转化BL21菌种。

制备BL21化学感受态细胞，用pFN-Cas9载体进行转化。用含amp抗性的LB平板筛选出阳性克隆。

2、按照说明书将含pFN-Cas9质粒的BL21菌种制备为电转化感受态细胞。




二、构建pFG-sgRNA载体。

1、插入片段PCR扩增：




扩增体系：

sgRNA-F1 primer	1ul
sgRNA-R2 primer	1ul
LacZ-target	0.5ul
PCR template	0.5ul
Clone Direct PCR Mix	25ul
H2O	22ul
Total	50ul




反应程序：
95℃      2min

95℃     10sec
60℃     15sec     10 cycles
72℃     30sec

95℃     10sec
58℃     15sec     15 cycles
72℃     30sec
琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物备用。




2、pFG-sgRNA载体连接：




配制连接体系：

胶回收的PCR产物	0.5ul
pFG-sgRNA载体	2ul
Loop Ligation Enzyme Mix	0.5ul
Loop Ligation Buffer	1ul
H2O	6ul
Total	10ul




连接反应：

37℃      5min
16℃     10min

10 cycles

3、连接产物转化dH5a感受态，挑取克隆测序。正确的质粒命名为pFG-sgRNA-lac。




三、合成同源重组模板。

1、PCR扩增同源重组模板：




扩增体系：

LacZ-HR-F	2ul
LacZ-HR-R	2ul
Clone Direct PCR Mix	25ul
H2O	21ul
Total	50ul




扩增条件：
95℃      2min
95℃     10sec
58℃     15sec     25 cycles
72℃     30sec



乙醇沉淀回收PCR产物，定量。




四、pSG-sgRNA载体、重组模板转化表达Cas9蛋白的BL21感受态。




1、按照下表配制转化Mix，分别电转化表达Cas9蛋白的BL21感受态细胞。

组1	组2
pSG-sgRNA-lac 50ng	pSG-sgRNA 50ng
重组模板 400ng	重组模板 400ng




• 转化产物涂含Xgal/amp/Str平板，30℃培养过夜。挑取克隆用lacZ-JD-F/R进行鉴定。

实验结果

1、PCR克隆鉴定实验结果：



2、Xgal平板显色检测结果



用到的产品：

大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒（英茂盛业，CR3011）