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TALEN原理

TALE原理

    AL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别 C，NI识别A，NN识别G。为获得识别某一特定核酸序列的TALE，只须按照DNA序列将相应TAL单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同，对于哺乳类动物包括人类，一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。组成的TALE识别模块与核酸酶或转录激活因子相连，导入细胞即可实现基因敲除或激活。

TALEN基因敲除原理

    将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。

    将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近， 形成二 聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA， 形成DSB（Double-Strand Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA， 在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。