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RNAi基因敲减细胞系构建服务

 英茂盛业的RNAi基因敲减细胞系构建基于慢病毒表达系统，一般采用U6启动子驱动的pLVshRNA-puro或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体构建RNA干扰稳定细胞株，服务内容包括干扰载体构建、靶点筛选、干扰效率验证及稳定细胞筛选和克隆。

服务特点

1、从靶点筛选到细胞株构建一站式服务。

2、采用慢病毒系统构建，基因整合稳定。

3、保证干扰效率大于80%（以RT-PCR检测靶基因mRNA表达结果为依据）。

4、根据您的需要可以提供经济实惠的多克隆细胞系或者高品质的单克隆细胞系。具体细胞系选择请见相关介绍。

您需提供的资料

1、待构建野生细胞株及细胞株培养资料。

2、干扰靶基因GeneID或mRNA序列。

3、目的基因功能相关参考文献及其他您认为有参考价值的资料。

我们提交的内容

1、实验报告内容：

    A 慢病毒RNAi载体构建报告及测序结果；

    B 干扰靶点筛选报告；

    C 稳定细胞系筛选实验报告。

2、产品内容：

    A 已构建慢病毒RNA干扰载体；

    B 多克隆细胞系构建服务提供目的基因敲减细胞株及EGFP表达对照细胞株各一株，单克隆细胞株构建服务提供目的基因敲减单克隆细胞株2-3株及EGFP过表达对照细胞株一株。

 

RNA干扰细胞株构建服务案例：

服务内容：采用慢病毒RNA干扰载体pLVshRNA-EGFP（2A）Puro构建ANLN RNA干扰慢病毒载体和阴性对照载体。包装为慢病毒后感染Hela细胞，通过puromycin筛选ANLN RNA敲减稳定多克隆细胞株，再用有限稀释法获得稳定单克隆细胞株。

一、靶点设计和载体构建

靶点设计：

载体名称	插入序列（5’-3’）	靶点
pLVshRNA-ANLN-1	GGATCAATAGCAGCAGTGTTTCAAGAGAACACTGCTGCTATTGATCCTTTTTT	GGATCAATAGCAGCAGTGT
pLVshRNA- ANLN-2	GGCTGAACTCAAGATTGGATTCAAGAGATCCAATCTTGAGTTCAGCCTTTTTT	GGCTGAACTCAAGATTGGA
pLVshRNA- ANLN-3	GCAGGAAGCTACATTCTGTTTCAAGAGAACAGAATGTAGCTTCCTGCTTTTTT	GCAGGAAGCTACATTCTGT
pLVshRNA- ANLN-4	GCCTCAATTTCCAGCTCTGTTTCAAGAGAACAGAGCTGGAAATTGAGGTTTTTT	CCTCAATTTCCAGCTCTGT
pLVshRNA-Control	ATCGACTAGCCACTTAGACTTCAAGAGGTCTAAGTGGCTAGTCGATTTTTTTT	ATCGACTAGCCACTTAGAC

合成RNA干扰序列，通过EcoRI、BamHI酶切位点构建到慢病毒载体pLVshRNA-EGFP（2A）Puro。

图一：慢病毒shRNA干扰载体图谱

一、细胞筛选及克隆检测：

构建的RNA干扰载体和对照载体包装为慢病毒后转染Hela细胞。用puromycin筛选稳定细胞株，提取总RNA进行qPCR检测。

检测结果显示，4个靶点的RNA干扰效果均比较好，减少ANLN RNA原表达量达80%以上。其中靶点3的效果最好，达到90%。后续我们采用靶点3进行了单克隆细胞筛选。

单克隆细胞的检测结果如下：

 

常见问题和资料

• 稳定细胞株构建服务常见问题

• 单克隆细胞系和多克隆细胞系特点及选择指南