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采用深度学习和CRISPR-Cas13d直向同源物发现优化RNA靶向

Deep learning and CRISPR-Cas13d ortholog discovery for optimized RNA targeting - ScienceDirect

需要有效和精确的哺乳动物转录组工程技术来加速生物发现和RNA治疗。尽管可编程CRISPR-Cas13核糖核酸酶有希望，但由于对指导RNA设计规则和脱靶或侧链RNA切割导致的细胞毒性的不完全了解，它们的实用性受到了阻碍。在这里，我们量化了超过127，000个rfx cas 13d(CasRx)guide RNA的性能，并系统地评估了七个机器学习模型，以建立跨多种人类细胞类型正交验证的guide效率预测算法。深度学习模型解释揭示了高效向导的首选序列基序和二级特征。我们接下来鉴定并筛选了46种新的Cas13d直向同源物，发现DjCas13d实现了低细胞毒性和高特异性——即使是在靶向敏感细胞类型(包括干细胞和神经元)中的大量转录物时。我们的Cas13d guide效率模型成功地推广到DjCas13d，说明了将机器学习与直向同源物发现相结合以推进人类细胞中RNA靶向的力量。

Cas13家族因存在两个保守的HEPN核糖核酸酶基序而统一，这些酶在与Cas13指导RNA指定的同源靶RNA结合时被激活。4，5，13，14根据序列多样性和结构域结构已经定义了几种亚型。Cas13d酶——特别是来自黄色链霉菌菌株XPD3002 (CasRx)7的工程cas 13d——是迄今为止报道的哺乳动物和植物细胞中最小和最有效的Cas13 RNA靶向效应物，15，16，17促进了它们作为RNA靶向工具的进一步表征和优化。为了在高通量应用中成功应用Cas13d，设计高效指导RNA的能力至关重要。最近为了解和预测Cas13d指导活动所做的努力已经朝着这个方向迈出了第一步，通过使用4个转录本的2，918个指导RNA的数据集来训练随机森林(RF)模型15，并通过使用10，279个指导的组合数据集来训练深度学习模型18。除了相对较小的数据集之外，手动选择指导序列特征15或缺乏二级特征18也限制了对Cas13d目标偏好的更广泛了解。

在这里，我们进行了迄今为止最大的Cas13d筛选，通过测量它们对人类细胞中细胞增殖的影响，量化了超过127，000个guide RNAs平铺55个基本转录物的CasRx guide效率。我们系统地比较了该数据集上的一系列计算模型，以预测向导活动。深度学习卷积神经网络(CNN)模型能够最准确地预测高效指南。模型解释使我们能够发现间隔区位置15–24的优选序列基序，以及对高效导向的低导向自由能和高目标区域可及性的偏好。我们针对正交数据集验证了该模型，并证实了跨几个目标转录本和五种不同细胞类型的高准确性。

在迄今为止在结构上表征的Cas13亚型中，由两个HEPN结构域形成的RNA切割位点位于导向结合沟的远端，13，14，19，这可导致在体外由靶RNA结合时激活的HEPN结构域切割非靶旁观者RNA分子(称为“侧枝”切割)。关于常规使用的哺乳动物细胞系中Cas13a、b和d系统的初步报告显示，真核细胞中的脱靶效应程度较低。6，7，8然而，最近有几个研究小组报告了CasRx、LwaCas13a和PspCas13b在敏感细胞类型中的细胞毒性和更明显的脱靶效应，20，21体内，22以及靶向高表达转录物时。23

为了了解这种细胞毒性是否在Cas13直向同源物中共享，我们从最近报道的原核基因组和宏基因组重叠群中计算鉴定了46种新的Cas13d直向同源物，并筛选它们在人类细胞中的靶转录敲除活性和细胞毒性作用。我们鉴定了DjCas13d，这是一种高效的直向同源物，在靶向多种细胞类型(包括人胚胎干细胞(hESCs)、神经祖细胞和神经元)的高表达转录物时，具有最小的可检测细胞毒性。此外，我们表明，我们基于CasRx的导向设计模型扩展到DjCas13d，并准确地选择高效的导向，说明其跨效应器和细胞类型的普遍性。总的来说，我们通过开发基于高通量导向筛选(https://www.RNAtargeting.org)的稳健的Cas13d导向设计算法，并确定用于有效RNA靶向的紧凑和高保真Cas13d直向同源物，推进了转录组工程工具箱。最后，我们概述了一种策略，以系统地开发和解释基于序列分类的深度学习模型。