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CoCas9是一种来自人类微生物组的紧凑核酸酶，可以用于高效和精确的基因组编辑

原文：CoCas9 is a compact nuclease from the human microbiome for efficient and precise genome editing | Nature Communications

CRISPR-Cas工具箱的扩展对于加速遗传疾病疗法的开发非常必要。在这里，通过检索大规模扩展的宏基因组组装基因组库（主要来自人类微生物组），我们发现了II型CRISPR-Cas基因座的大量变种（n = 17，173）。在这些酶中，我们鉴定出CoCas9，这是一种从未培养的Collinsella物种中分离出的具有较小分子大小（1004个氨基酸）的强活性高保真核酸酶。CoCas9可以通过腺相关病毒（AAV）载体与其sgRNA有效共递送，在小鼠视网膜中获得有效的体内编辑。通过这项研究，我们发现了一系列以前未表征的Cas9核酸酶，包括CoCas9，这丰富了基因组编辑工具箱。

CRISPR工具极大地加速了遗传病治疗方法的发展。然而，临床的进一步发展强烈依赖于应对基因组编辑挑战的工具的多样化1。最关键的方面之一是输送，因为Cas核酸酶和衍生的融合产物(包括碱基编辑2)的分子大小很大。用于体内递送的最有效和最广泛使用的方法是AAV载体，然而，由于尺寸限制(货物小于4.7 kbp)2，3，其几乎不与CRISPR技术兼容。事实上，最常用的来自化脓性链球菌的cas 9(sp cas 94)及其单一指导RNA (sgRNA)和所有必要的调控区不能容纳在一体化AAVs中。只有很少的其他Cas9用于AAV，主要是来自金黄色葡萄球菌(SaCas95)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Nme2Cas96)的Cas9，然而它们是不如SpCas9有效的核酸酶。总的来说，原核生物中存在的CRISPR-Cas系统的多样性尚未被利用。

通过宏基因组学进行全微生物组测序7，然后重建宏基因组组装基因组（MAGs），已经鉴定出大量未表征的原核物种8，9，10，其中许多物种编码系统发育不同的Cas9直向同源物11，12。大多数质量控制的mag质量足够高，能够对整个Cas9基因座进行全序列表征，这种未发现的多样性有可能发现具有理想特性的核酸酶，以解决治疗应用的复杂性。

鉴于目前SpCas9分子大小的限制，我们在一个大型数据库中搜索未描述的小Cas9变异体，该数据库由超过154，000个微生物基因组组成，这些基因组由超过9400个人类相关宏基因组重建而成，其中包括超过3000个以前未鉴定的细菌物种8。我们鉴定和表征了CoCas9，这是一种来自未充分表征的Collinsella物种的核酸酶，在编辑效率和精度方面具有引人注目的编辑特征，可以将其与AAV载体中的sgRNA包装在一起用于体内递送。

CoCas9是一种高活性的核酸酶和碱基编辑器

CoCas9 sgRNA是通过在完全支架(FS) sgRNA中通过GAAA四环融合crRNA+tracrna(图2c)而产生的(补充数据1)。在之前的工作5，15，16，17之后，FS sgRNA被改造以稳定二级结构(FS-opt)，缩短重复:反重复环(TS)，或者两种修饰同时引入(TS-opt)(补充数据1)。工程化的sgRNAs显示出相似的编辑效率(补充图4a ),因此此后使用TS-opt形式。然后，我们通过靶向两个基因组位点，测试了不同的间隔区长度，从22到24 nt，并注意到在HBB基因座的23 nt长的间隔区有小的改善(补充图4b)。然后在HEK293T细胞中针对一组26个基因座测量CoCas9的效率，显示可变的编辑水平，在特定靶标上具有高达55%的indel(HEK site 1和IL2RG，图3a)。为了比较CoCas9和广泛使用的SpCas94，我们为两个直向同源物选择了具有重叠PAM和间隔序列的24个基因座(补充图5a)。尽管总体效率降低(平均差异12.2%，补充图5b)，但CoCas9在大多数基因座中产生了可比较的indels百分比。这两个直向同源物的表达水平被证实排除了依赖于蛋白质丰度的编辑可变性(补充图6)。

为了测试CoCas9的精度，我们通过GUIDE-seq18对SpCas9进行了全基因组比较脱靶（OT）分析。为此目的，我们选择了四个基因座（HPRT、VEGFAsite2、ZSCAN2和Chr6），其中两种核酸酶显示出具有重叠间隔序列的相似编辑效率（补充图5a和补充数据2）。在所有检测的基因座中，CoCas9产生的OT裂解比SpCas9少得多（图3b和补充图7）。在OT基准位点VEGFAsite218，19上，CoCas9的优异表现尤为引人注目，其中CoCas9产生的OT位点比SpCas9少19倍（分别为101和1950个OT位点，补充图7b）。值得注意的是，在该基因座，CoCas9在特定位点的裂解比SpCas9产生的裂解高180倍（分别为GUIDE-seq读数的39.0%和0.2%，图3b和补充图7b）。

然后，我们通过融合其镍酶版本（RuvC-I结构域中携带D23A突变）与Tad-8e腺苷脱氨酶结构域20，21以产生CoABE8e来测试CoCas9碱基编辑。在测试的19个基因座中，我们根据靶基因座检测到高达55%的A》G转换效率（图3c）。从与SpCas9衍生的碱基编辑21（spabe 8e）的比较分析来看，CoCas9显示出整体较低的碱基编辑效率和在重叠间隔区靶向的特定位点的不同活性窗口（补充图8）。

CoCas9优于其他小型Cas9直向同源物

由于长度缩短，CoCas9与一体式AAV交付兼容。目前，非常少的具有可观编辑效率的Cas9，主要是SaCas95和Nme2Cas96，可以与它们的sgRNAs6，22一起容纳在这些载体中。通过分析具有重叠间隔区的sgRNAs靶向的11个基因组位点，将这些直向同源物与CoCas9进行比较。我们观察到，在大多数情况下（11个基因座中的7个），CoCas9比SaCas9产生更多的indels，而Nme2Cas9与其他两种核酸酶相比活性总体较低（图4a）。CoCas9和SaCas9的特异性分布通过GUIDE-seq进行测试，选择五个基因组基因座，其中两个直向同源物显示相似的活性（TRAC、Chr6、TRBC、PDCD1、VEGFAsite3）（图4a和补充图9a）。在两个基因座（PDCD1分别有n = 3和n = 15个OT位点，VEGFAsite3分别有n = 0和n = 31个OT位点）中，CoCas9产生的OT远少于SaCas9（补充图9b），而在其余基因座中几乎没有观察到两种核酸酶的OT（图4b和补充图9 b–h）。为了加深CoCas9与小Cas9直向同源物（SaCas9、Nme2Cas9和CjCas913）的比较，我们纳入了具有非重叠PAM和间隔区的靶位点（每个直向同源物n = 18个sgRNAs）（补充图10和补充数据2）。总体而言，通过考虑重叠和非重叠指南，CoCas9表现出30.3%的平均编辑效率，明显比Nme2Cas9和CjCas9活跃（分别为16.7%和11.8%的平均编辑效率），与SaCas9相当（28.1%的平均编辑效率）（补充图10b）。通过分析PAM在人类基因组中的可用性来比较这些直向同源物的靶向范围。CoCas9的PAM以与SpCas9相似的频率（分别为11.8%和10.0%）跨越整个基因组，并且可以比SaCas9和Nme2Cas9的PAM（分别为2.9%和9.9%）更频繁地被发现，因此支持CoCas9作为编辑工具的广泛适用性（图4d）（参见方法）。

小Cas9s用于生成分子大小减小的碱基编辑器23。我们分析了CoCas9和SaCas9衍生的基础编辑器(分别为CoABE8e和SaABE8e21)的编辑配置文件，它们具有重叠的PAM和间隔区。两个碱基编辑者显示了相似的编辑特征，其中CoABE8e在5个位点中的3个位点更活跃，而在一个位点几乎不活跃(TRAC)(图4e和补充图11)。为了将分析扩展到使用小型直向同源物(Nme2Cas9、SauriCas9和CjCas9)23生成的更多基本编辑器，我们还分析了以非重叠PAM为目标的站点。从针对每个碱基编辑器的3个基因组座位的9个sgRNAs的分析中，我们获得了非常异质的编辑概况(补充图12a–c)。对3个受检基因座中每个直向同源物产生的最高A > G转化率的评估显示了在所分析的碱基编辑者中总体相似的活性(补充图12d)。为了评估CoABE8e的治疗潜力，我们从ClinVar24中检索了40，871 G > A的致病突变，并预测了可能被所有测试碱基编辑器靶向的部分(见方法)。值得注意的是，10.2%的考虑突变可以仅被CoABE8e靶向(图4f)。

结论

通过对来自人类微生物组的大规模扩展的微生物基因组数据库的查询，我们发现了一个庞大的Cas9直向同源物库，这些直向同源物具有令人信服的基因组编辑特性。通过选择性搜索低分子量Cas9，我们获得了与AAV载体兼容的直向同源物，从而克服了使用双AAV来递送ca S9及其sgRNA的必要性。在已鉴定的CRISPR基因座中，我们发现了CoCas9，这是一个紧凑（1004 aa）和高效的高保真Cas9，具有复杂的PAM序列（5’-n4 gwnt-3’，5’-n4 gcdt-3’和5’-n4 atdt-3’），尽管其长度与人类基因组中11.8%的位点匹配，这一频率与sp ca S9（10.0%的位点）相当。通过将CoCas9与其他小Cas9直向同源物（即SaCas9、Nme2Cas9和CjCas9）进行比较，我们表明CoCas9表现出与SaCas9相似的编辑活性，并且显著高于Nme2Cas9和CjCas9。然后，我们比较了CoCas9和SaCas9的特异性，证明CoCas9比SaCas9更精确，尽管后者的PAM范围较窄（占人类基因组中位点的2.9%），这有望减少脱靶事件的数量。因此，尽管它们在靶向活性上相似，但就其内在特异性和靶向范围而言，CoCas9优于SaCas9。由于它们的PAM序列不相容，直接比较CoCas9和Nme2Cas9的特异性是不可行的，NME 2 cas 9的特异性也非常精确6。

与V型核酸酶相比，II型Cas核酸酶的优势是有机会通过两个催化结构域之一的失活产生有效的碱基编辑。我们发现，CoABE8e具有高效的碱基编辑活动，类似于由小Cas9直向同源物衍生的其他碱基编辑器，从而扩展了当前工具的靶向范围。然而，CoABE8e的宽编辑窗口可能对应于高比例的不需要的旁观者编辑，这是所有ABE8e基本编辑器的共同限制23，28。最近开发的ABE9 base editors28显示的编辑窗口要窄得多，可以用来解决这个问题。

总的来说，通过在临床相关模型（如HSPCs和鼠视网膜）中证明CoCas9的高活性，我们证明了从宏基因组数据中识别的Cas9直向同源物的天然多样性可以扩展基因组编辑工具箱，并有可能解决基因治疗应用的复杂性。此外，与致病物种（如化脓性链球菌）的直向同源物相比，从人类微生物组的共生物种中鉴定的Cas9直向同源物的潜在优势可能是降低预先存在的适应性免疫，这应在未来的研究中进行调查。最后，基于结构的工程和定向进化方法已经成功地产生了大量具有增强活性、特异性或宽松靶向范围的工程Cas9变体29。虽然这项研究的重点是将CoCas9与天然存在的直向同源物进行比较，但其与工程变异体相比的表现仍有待评估。在这方面，CoCas9是通过工程方法进行优化的重要候选物质，值得进一步研究。