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一种新的、简单的、高通量分离大肠杆菌K-12全基因组转座子插入突变体的方法

作者开发了一种新的、简单的、高通量的方法来分离大肠杆菌K-12的全基因组转座子插入突变体。该方法的基本思想是通过首先插入一个小型转座子，随机破坏在Kohara文库上克隆的DNA片段上的基因，然后通过同源重组将破坏的基因从载体转移到大肠杆菌染色体上。利用这种方法，我们构建了一组8402 Kmr顺式二倍体突变体，染色体上带有一个微小的Tn10插入突变和相应的野生型基因，以及一组6954个由顺式二倍体突变体衍生的单倍体突变体。所用策略的主要优势在于可以识别生长所必需的基因或位点。初步结果表明，415个开放阅读框对于大肠杆菌细胞的生长是必不可少的。

作为一种模式生物，大肠杆菌在生物研究中发挥重要作用，迄今为止积累的大量数据有助于理解各种细胞过程。然而，通过全基因组DNA测序鉴定的4300个开放阅读框中，约有一半的功能尚不清楚。作为对大肠杆菌基因进行系统功能分析的第一步，我们开发了一种简单、高通量的方法来分离大肠杆菌K-12的全基因组转座子插入突变体。本章的目的是较为详细地描述本文开发的方法和大肠杆菌K-12的迷你Tn10插入突变体的最新集合。

该方法的基本思想是通过插入一个小型转座子，随机破坏在Kohara文库中克隆的DNA片段上的基因(1)；然后通过同源重组将断裂的基因导入大肠杆菌染色体。因为Kohara克隆(携带大肠杆菌DNA片段的有序λ克隆的集合[1])实际上覆盖了整个大肠杆菌基因组，所以该方法应允许在全基因组范围内分离插入突变体。

如图1所示，该方法由四个步骤组成。第一步是通过在携带mini-Tn10(lacZ-kan供体质粒的宿主菌株中繁殖，为每个Kohara克隆产生随机突变亚文库。第二步是通过克隆的插入物和大肠杆菌染色体上的同源区之间的重组使突变的噬菌体亚文库溶源化(即构建染色体上含有野生型和断裂等位基因的部分二倍体)。该步骤的唯一要求是提供cI阻遏物，因为Kohara克隆的cI基因已被删除。Kohara克隆中int基因的缺失通过抑制染色体上λ附着位点的整合促进了同源重组。第三步是选择通过重复区域之间的重组自发产生的非溶源性插入突变体(即，从部分顺式-二倍体构建单倍体破坏突变体)。最后一步是通过跨转座子-染色体边界测序来定位引入的转座子插入，并鉴定被破坏的基因。

这种策略的主要优点是基因或位点对于E.可以鉴定大肠杆菌的生长和存活。即使插入发生在生长所必需的基因(或位点)内，携带野生型等位基因和断裂等位基因的顺式二倍体细胞也有望存活。相反，在单倍体品系中，插入生长所必需的基因是致命的。因此，通过测试单倍体破坏突变体是否来自于顺式二倍体细胞，可以鉴定生长必需的基因。