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新的Cas9双质粒系统优化大肠杆菌基因编辑

pCas/pTargetF是目前用于大肠杆菌基因组编辑最受欢迎的系统之一，根据Addgene、MolecularCloud以及实验室自行寄出的数据显示，pCas已被使用723次，pTargetF已被使用615次，但有研究者反映pCas/pTargetF在某些大肠杆菌菌株如BL21(DE3)中编辑不理想，体现为无法获得转化子。2021年3月25日，中科院杨晟实验室在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊发表研究论文“A modified pCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assisted genome editing in Escherichia coli”。

原始的pCas/pTargetF系统：

在pCas/pTargetF系统中，pCas质粒上携带表达Cas9的基因、用于质粒丢除的温敏型复制子、由阿拉伯糖诱导的λ-Red系统和一个由IPTG诱导的、且锚定pTargetF质粒上pMB1复制子的sgRNA。pTargetF质粒上除pMB1复制子外，还包含靶向目标基因的sgRNA。修复模板可以以PCR产物的形式提供或构建至pTargetF质粒上。

在使用过程中，需先将pTargetF质粒上的sgRNA进行更新，然后将pTargetF与同源臂引入含有pCas的大肠杆菌中进行目的基因编辑。编辑成功后，可通过IPTG诱导靶向pMB1复制子的sgRNA表达，从而丢除pTargetF质粒，而pCas质粒的丢除可借助37°C培养。

新的pEcCas/pEcgRNA系统：

在本研究中，我们推测pCas质粒上锚定pTargetF质粒复制子的sgRNA在BL21(DE3)中存在更为严重的渗漏表达，使得pTargetF质粒被切割，因此在双抗平板上拿不到转化子。于是，我们接下来对pCas / pTargetF系统进行更新：（1）对于pCas:a.将pCas质粒上锚定pTargetF质粒复制子的sgRNA表达启动子换为更严谨的鼠李糖诱导型启动子P_rhaB；2）再将原先pCas质粒上的温敏型复制子更新为非温敏型复制子；3）并将sacB基因添加至pCas质粒上，便于质粒丢除时在蔗糖培养基中进行反筛，最终获得pEcCas。（2）对于pTargetF:我们将末端含有BsaI酶切位点的ccdB基因替换至pTargetF上原始的20 bp特异序列上，生成pEcgRNA。CcdB对大肠杆菌Dh5a有致死性，可快速筛选获得含新的20 bp特异序列的pEcgRNA。

我们将pCas/pTargetF系统与更新后的pEcCas/pEcgRNA系统进行比较，证实了锚定pTargetF质粒复制子的sgRNA在BL21（DE3）中确实具有略高的渗漏表达。幸运的是，我们能够成功使用pEcCas/pEcgRNA系统编辑BL21（DE3）中的目标基因。

论文推出的升级版系统pEcCas/pEcgRNA具有以下优势：

1.    pEcCas可在37℃下进行操作，并添加sacB基因，利于质粒丢除；

2.    pEcgRNA质粒上更新间隔区（20 nt）更为方便，无需酶切等操作，只需合成两条24nt的部分互补引物，pEcgRNA骨架可大量预制切好待用，混合退火连接即可；

3.    pEcCas/pEcgRNA不仅在K-12大肠杆菌中能用，在B系和W系大肠杆菌中也实用。

4.    优化后的质粒丢除方法更为简便，从60小时缩短至32小时。

论文在4株K-12、2株B系、1株W系大肠杆菌及1株塔特姆氏菌中成功测试了pEcCas/pEcgRNA系统（共编辑70个位点）。论文还优化出一套质粒丢除新策略，为使用者提供了完整编辑方案。作者希望通过将该编辑质粒开放给学术圈和工业圈，弥补pCas/pTargetF在大肠杆菌中编辑效果的不足，同时能收获对pEcCas/pEcgRNA的反馈意见。