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更大的CRISPR-Cas12a工具箱，更广泛的基因组覆盖率和更高的靶向

最近发表在《基因组生物学》上的研究发现了几个新的CRISPR-Cas12a位点，这是一种用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统。本文的两位作者，李伟和滕飞，向我们介绍了他们的研究，以及如何增强和扩展基因组编辑工具箱。

在短短几年内，一项被称为“CRISPR”的技术不仅改变了科学家在DNA上做出特定改变的方式，也改变了人们对治疗疾病的看法。与此同时，微生物界的CRISPR-Cas系统加速了新的基因组工程工具箱的出现。

基因组生物学的一项新的研究,完成李魏博士领导的研究小组在动物学研究所,中国科学院,为我们提供了更多的可行的Cas12a / Cpf1直接同源,CRISPR-Cas-based基因组工程扩展我们的选择,提高了定位效率Cas12a酶通过工程和优化CRISPR RNA (crRNA)脚手架。

新兴的crispr - casi介导的基因组编辑技术在基础研究和生物医学应用中具有广阔的应用前景。到目前为止，CRISPR-Cas系统已被命名为6个类型和20多个子类型。其中，CRISPR-Cas12a是利用CRISPR-Cas系统编辑哺乳动物基因组的第二种类型(V型)。

Cas12a具有独特的功能，是CRISPR-Cas9系统的互补。然而，仍然存在一些缺点，需要改进，如较低的基因组覆盖率和较少的靶向效率。

扩展的曲目的Cas12a工具箱

在我们最近发表在《基因组生物学》(Genome Biology)杂志上的研究中，我和同事们“挖掘”了数据库，发现了几个新的CRISPR-Cas12a位点，它们被用来执行哺乳动物基因组编辑功能。我们证明了六个新的Cas12a标准能够编辑哺乳动物细胞中的基因组。

我们发现V-A Cas12a系统是保守的，特别是在成熟的crRNA序列和第二结构中。在此基础上，我们推断出它们所必需的PAM序列的保守性。我们的体外数据表明，这些新鉴定的Cas12a核酸酶利用了5 ' t丰富的PAM。因此，我们为Cas12a核酸酶提供了更多的选择，使其能够有效地编辑哺乳动物基因组。

使用非标准PAMs增加基因组覆盖率

我们还发现，这6个Cas12a标准中有一些可以识别更简单的5 ' -TTN PAM，这表明原则上基因组覆盖率比广泛使用的AsCas12a和LbCas12a增加了4倍。此外，在我们的体外裂解实验中，我们发现HkCas12a可以利用非标准PAMs (5 ' - yyn和5 ' - tbbn -)。虽然在细胞系中测定的PAM序列较少，但我们也可以使用5 ' -YTN和5 ' -TYYN PAMs实现HkCas12a对哺乳动物基因组的编辑。与典型的5 ' -TTN PAM相比，HkCas12a识别的PAMs使HkCas12a在哺乳动物基因组中的靶向范围增加了三倍。

通过优化crRNA支架提高Cas12a蛋白的靶向效率

在我们的研究中，我们观察到不同的crRNA支架可以影响Cas12a蛋白的靶向效率，尽管在大多数情况下它们会降低甚至消除它们的活性。但在极少数情况下，crRNA支架环区的某些变化能够增加Cas12a核酸酶的活性。我们成功地筛选出了一种变异(crRNA4n96)，它可以显著提高Cas12a-medaited基因组编辑效率。

总的来说，我们开发了6个新的Cas12a基因组编辑工具箱，增加了基因组的覆盖率，为我们提供了更多的基因组编辑选择。重要的是，通过对crRNA支架的工程设计和优化，我们能够提高Cas12a标准品的靶向效率。