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spCas9-HF1高保真Cas9蛋白显著降低脱靶效率

Cas9蛋白被广泛用于基因敲除实验中对DNA进行定点切割。但是Cas9蛋白在基因组上的非特异切割会导致不需要的突变产生。美国麻省总医院研发的高保真一种CRISPR-Cas9核酸酶有望提高spCas9核酸酶的特异性，极大降低的Cas9蛋白的脱靶率。该研究发表在Nature杂志上。

该文作者J. Keith Joung博士表示：“我们构建出了一种Cas9变异体，它可以将脱靶效应降低至即使采用最敏感的方法我们也无法检测到的水平。降低甚至消除CRISPR/Cas9脱靶率是朝着实现临床应用迈进的重要一步。由于脱靶效应有可能扰乱试验结果，其对于研究应用也将产生极其重要的影响。因此，我们预想我们的高保真变异体将替代标准的Cas9用于许多研究和治疗应用中。”

CRISPR-Cas9核酸酶是由细菌DNA切割酶Cas9与一条可以结合靶DNA序列的sgRNA序列所组成，当前人们主要利用它来生成靶向性DNA断裂，由此导入一些遗传性改变。尽管相比以往的基因编辑工具更容易使用，CRISPR-Cas9核酸酶具有一个非常明确且重要的限制。正如Joung和其他研究人员在2013年的一些研究中所描述的那样，CRISPR-Cas9核酸酶可以诱导与目标序列相似的一些位点发生脱靶DNA断裂。Joung研究小组和其他的团队随后开展的一些研究虽然减少了这些脱靶效应，但却未完全及一致地消除它们。

Joung和同事们猜测，减少Cas9与靶DNA之间的互作或许可以更完全地消除脱靶效应，同时保留期望的目标互作。这一研究小组将焦点放在了这一事实上：Cas9酶自身的某些部分可以与目标DNA分子的骨架互作。追踪共同主要作者、麻省总医院病理学博士Vikram Pattanayak最初的观察结果，研究小组通过将结合DNA骨架的长氨基酸侧链换成无法生成这样的连接的短链，改变了Cas9介导的4个接触位点。

Pattanayak说：“我们以往的研究工作表明，Cas9有可能利用比其所需更多的能量结合了它的目的靶DNA位点，造成了一些不完全匹配的脱靶位点发生非必要的切割。我们推断，通过在这4个位点进行替换，我们可以除去一些能量在消除脱靶效应的同时保留全部的靶向活性。”
共同主要作者、麻省总医院分子病理学部Benjamin Kleinstiver博士，与Joung实验室研究技术人员Michelle Prew一起，随后任意组合改变1条、2条、3条或4条氨基酸侧链，测试了总共15种可能的变异体，发现了一种三个位点发生替代的变异体，和一种四个位点发生替代的变异体似乎显示出最大的前景，能够在区别出错误匹配靶位点的同时保留在人类细胞中的全部靶向活性。

研究人员随后更充分地确定了4条侧链发生替代的这一变异体的特征，他们将这一变异体命名为SpCas9-HF1。他们发现相比于未改变的原始SpCas9，在他们测试的37种不同的sgRNAs中，85%的sgRNAs诱导出了靶向效应。利用Joung实验室在2014年开发出的一种检测全基因组CRISPR-Cas9脱靶效应的高度敏感系统：GUIDE-Seq，该研究小组发现组合未改变的SpCas9与7种不同的sgRNAs诱导出了多达25个脱靶突变，而采用SpCas9-HF1与其中的6种导向RNAs则未产生可检测到的脱靶效应，采用第7种sgRNA只生成了一个脱靶位点。利用靶向深度测序实验进一步证实了这些结果。

研究还发现，当靶向以1或2种核苷酸构成的重复序列为特征的非典型DNA位点时——这些位点通常容易发生许多脱靶突变，SpCas9-HF1可以减少脱靶效应。他们还开发出了其他的SpCas9-HF1衍生物：HF2、HF3和HF4，它们可以消除在采用HF1变异体和少数sgRNAs时少数残余的脱靶效应。

研究人员还证实像天然的相似物一样，SpCas9-HF1能够结合其他有用的改变来扩展其功用。Joung实验室去年夏天发表在Nature杂志上的研究工作表明，诱导一系列氨基酸替换可以扩大未改造SpCas9的靶向范围。在当前的研究中，作者们证实在SpCas9-HF1中导入相同的改变也可以扩大这种高保真变异体的靶向范围。“这些结果显示，这些变异体可被当前使用CRISPR-Cas9技术的所有人广泛地使用。它们可以很容易地用于替代野生型SpCas9，并为将脱靶突变降低至无法检测到的水平提供了一种高效的方法。”

原文摘要：
High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects
CRISPR–Cas9 nucleases are widely used for genome editing but can induce unwanted off-target mutations. Existing strategies for reducing genome-wide off-target effects of the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) are imperfect, possessing only partial or unproven efficacies and other limitations that constrain their use. Here we describe SpCas9-HF1, a high-fidelity variant harbouring alterations designed to reduce non-specific DNA contacts. SpCas9-HF1 retains on-target activities comparable to wild-type SpCas9 with >85% of single-guide RNAs (sgRNAs) tested in human cells. Notably, with sgRNAs targeted to standard non-repetitive sequences, SpCas9-HF1 rendered all or nearly all off-target events undetectable by genome-wide break capture and targeted sequencing methods. Even for atypical, repetitive target sites, the vast majority of off-target mutations induced by wild-type SpCas9 were not detected with SpCas9-HF1. With its exceptional precision, SpCas9-HF1 provides an alternative to wild-type SpCas9 for research and therapeutic applications. More broadly, our results suggest a general strategy for optimizing genome-wide specificities of other CRISPR-RNA-guided nucleases

Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5. doi: 10.1038/nature16526. Epub 2016 Jan 6.